淀粉分支酶（1,4-α-glucan branching enzyme,简称GBE;EC 2.4.1.18）是一种糖基转移酶,它能够水解淀粉分子中的α-1,4糖苷键,并将水解下来的链段以α-1,6糖苷键的形式连接至受体链上形成分支。经淀粉分支酶改性后得到的高支化淀粉具有稳定性好、消化速度慢等特性,在食品、医药等领域已展现出良好的应用潜力。迄今为止,已报道的淀粉分支酶均实现了大肠杆菌的胞内异源表达,但由于分离提纯困难及表达系统的安全性限制了淀粉分支酶的工业化应用。本论文以一种来源于美洲红景天菌（Rhodothermus obamensis）STB05的淀粉分支酶（Ro-GBE）为研究对象,实现了Ro-GBE在枯草芽孢杆菌中的分泌表达。首先对其在枯草芽孢杆菌中的分泌途径进行了研究,系统优化了其摇瓶培养条件;随后探究了N末端亲/疏水性改造对Ro-GBE分泌表达的影响,实现了其最优突变体在发酵罐中的放大生产,并对突变体的应用性能进行了详细表征;最后,对该改造手段用于提升其它淀粉酶分泌能力的应用价值进行了评估。本研究为淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达提供了一种新思路,其主要研究内容和结果如下:首先,将来源于R.obamensis STB05的gbe基因插入表达载体p ST上,构建了重组质粒p ST/gbe;质粒经测序验证后转化至宿主B.subtilis WB600,得到基因工程菌B.subtilis WB600（p ST/gbe）。通过替换不同类型信号肽序列的方式,探究了枯草芽孢杆菌中不同分泌途径对Ro-GBE分泌表达的影响,发现Sec和Tat这两种经典分泌途径均不适用于Ro-GBE的分泌表达;只有在无信号肽的情况下,才能实现Ro-GBE的分泌表达。在TB培养基中37°C条件下发酵84 h后,胞外的Ro-GBE活力可达730.15 U/m L,远高于文献报道中其它淀粉分支酶在枯草芽孢杆菌中表达的胞外活力。其次,考察了发酵条件对Ro-GBE分泌表达的影响,确定了最佳发酵培养基。结果表明,在培养基组成为:酵母粉30 g/L,大豆蛋白胨12 g/L,玉米淀粉4 g/L,葡萄糖4g/L,KH2PO4 2.3136 g/L,K2HPO4 16.4318 g/L,培养基初始p H为7.0,发酵温度为37°C的条件下发酵84 h后,胞外Ro-GBE活力可提升至1196.28 U/m L,是对照的1.64倍。随后,为研究Ro-GBE无信号肽分泌表达的机理,并利用这一特性提升其胞外分泌水平,对可能存在类信号肽功能的N末端序列进行了亲/疏水性分析,通过区域突变的方式探究了N末端亲/疏水性变化对Ro-GBE胞外分泌的调控作用。结果表明,在一定范围内,随着N末端亲水性的提高,Ro-GBE的胞外分泌量也逐步增多。在37°C条件下发酵84 h后,N末端亲水性突变体W3R/L4R的胞外酶活比野生型提高75.53%,推测可能是由于Ro-GBE N末端的loop结构具有识别并寻找细胞膜上的蛋白转运体作为“出口”的功能,而N末端亲水性的增加有利于提高loop的灵活性,进而加快了其移动及探寻“出口”的速度。同时,N末端精氨酸数量的增加会导致突变体W3R/L4R的正电荷增多,更促进了这段loop与细胞膜上带负电基团的结合,使得蛋白在细胞膜内侧大量聚集,进而加速分泌至胞外。随后,在5 L容积发酵罐中验证了N末端亲水性突变体W3R/L4R的胞外分泌能力及实现大批量发酵生产的可能性。在接二级种、接种量为10%、不补料的情况下,N末端亲水性突变体W3R/L4R在发酵罐内的产酶水平可达1430.75U/m L,相比野生型提升53.99%,且罐内发酵时长比摇瓶发酵缩短了57.14%。最后,对Ro-GBE N末端亲水性突变体W3R/L4R的酶学性质进行了表征,并对其应用潜力进行了评价。结果表明,N末端亲水性突变并未使Ro-GBE的比酶活及热稳定性发生显著变化,对其转苷特性也未造成影响。经突变体W3R/L4R改性后的麦芽糊精溶液在室温下储存180 d后透光率依然处于90%以上,与原麦芽糊精溶液（室温下储存4～5 d即完全浑浊）相比,显著提高了产品的透明度稳定性。这种改性效果与野生型的改性效果一致。由于N末端亲水性突变仅提高了分泌至发酵液中的蛋白总量,而对酶的催化特性未造成明显影响,相应突变体不仅在麦芽糊精改性效果上与野生型无显著差异,酶液的实际使用体积也远低于野生型,说明这种分子改造手段具有较好的应用价值,可为其它淀粉酶在分泌能力改造方面提供一定的理论参考。