论文部分内容阅读
目的探讨烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依赖性蛋白脱乙酰基酶sirtuin-6(SIRT6)蛋白在结肠癌组织中的表达情况与结肠癌患者临床病理参数之间的关系,阐明SIRT6蛋白与结肠癌发生发展的联系。通过质粒转染技术调控SIRT6蛋白在结肠癌HCT116和RKO细胞系中的表达,探究调控SIRT6蛋白表达后对结肠癌细胞生物学行为的影响,旨在明确SIRT6蛋白在结肠癌发生发展中的作用,为结肠癌的治疗提供新方法。方法1、选取术前均未行放化疗的100例结肠癌患者的结肠癌组织,采用组织芯片技术和免疫组织化学SP法检测结肠癌组织和癌旁组织中SIRT6蛋白的表达水平,用秩和检验分析SIRT6蛋白表达高低与各个临床参数的关系,Kaplan-Meier、单因素和多因素生存分析法,分析结肠癌病人的临床病理参数与预后的关系。2、采用Western-blot检测SIRT6蛋白的在RKO,HT-29,SW620,COLO205,HCT116结肠癌细胞中的表达水平,选择SIRT6蛋白表达最高的RKO细胞和蛋白表达最低HCT116细胞,通过将外源SIRT6质粒瞬时转染到HCT116结肠癌细胞系中使SIRT6蛋白过表达;将小分子干扰RNA(si RNA)转染到RKO结肠癌细胞系中使SIRT6沉默。通过q RT-PCR和Western blot实验方法从m RNA和蛋白水平验证SIRT6过表达与沉默细胞模型是否构建成功。3、采用CCK-8法检测细胞活力;平板克隆实验检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞凋亡情况,进而研究结肠癌细胞过表达SIRT6或者敲低SIRT6后对结肠癌细胞生物学行为的影响。结果1、SIRT6蛋白在细胞核和胞浆均有表达,但在结肠癌癌旁组织中的表达均显著高于癌组织。Kaplan-Meier生存曲线显示,SIRT6蛋白在细胞核表达高,年龄小,TNM分期低,T、N、M分期低的患者预后更好。单因素和多因素分析显示,年龄小,T、N分期低,SIRT6蛋白在细胞核中高表达的结肠癌病人的预后更好,且可能是独立的预后因子。2、经q RT-PCR和Western blot检测发现,质粒瞬时转染的过表达结肠癌细胞HCT116与对照组(转染空质粒)和空白组相比,SIRT6在RNA水平和蛋白水平表达均增强,差异显著;si-SIRT6转染下调结肠癌细胞RKO,与对照组(转染NC-si RNA)和空白相比,SIRT6在RNA水平和蛋白水平表达均降低,差异显著,细胞模型构建成功,可用于后续实验。3、过表达SIRT6使结肠癌细胞的细胞活力、增殖能力降低,凋亡细胞数量增加。说明过表达SIRT6抑制了结肠癌细胞生长,促进了结肠癌细胞凋亡。敲低SIRT6后细胞活力、增殖能力均增高,凋亡细胞减少。说明敲低SIRT6促进结肠癌细胞生长,抑制了结肠癌细胞的凋亡。结论结论:SIRT6蛋白在结肠癌组织表达显著低于癌旁组织表达。SIRT6蛋白在细胞核中高表达的结肠癌病人预后更好,该蛋白可能是结肠癌独立的预后因子。过表达SIRT6可以抑制结肠癌细胞生长,促进结肠癌细胞凋亡。敲低SIRT6促进结肠癌细胞生长,抑制了结肠癌细胞的凋亡,可能作为结肠癌的生物标记物。