研究背景产科抗磷脂综合征（obstetric antiphospholipid syndrome,OAPS）是由抗磷脂抗体（antiphospholipid antibodies,aPLs）介导,以复发性流产、重度子痫前期和胎儿生长受限等胎盘源性病理妊娠为主要临床特征,伴或不伴血栓形成的系统性自身免疫性疾病,严重威胁孕产妇的健康。根据2006年悉尼抗磷脂综合征诊断标准,将OAPS病理妊娠的范围进行了阐述,即小于妊娠10周的复发性流产,大于妊娠10周的流产和死胎,以及胎儿生长受限、子痫前期等胎盘功能不全所致的早产。OAPS发病机制尚未明确,通常考虑与凝血功能障碍和免疫介导损伤有关,其并发症的发生与胎盘功能相关受损有关。aPLs是一组针对于带负电磷脂的自身免疫性抗体,主要靶标抗原是β2糖蛋白1抗原（β2-glycoprotein 1,β2-GPI）和凝血酶原。aPLs主要包括IgG型和IgM型抗心磷脂抗体（anticardiolipin antibody,ACL）、狼疮抗凝物（lupus anticoagulation,LA）和抗 β2 糖蛋白1抗体（anti-β2-glycoprotein 1 antibody,anti-β2GP1 Ab）,其中抗β2GP1抗体是导致OAPS的主要抗体。OAPS临床异质性极高,部分非典型OAPS患者仅符合分类标准的临床标准或实验室标准,使该疾病在诊断和治疗方面均存在诸多瓶颈。以阿司匹林联合低分子肝素的一线用药治疗只能缓解部分妊娠不良结局,妊娠结局良好的比例从30%增加到70-80%。但仍有约20%-30%的患者对此治疗方案无效。这种难治性OAPS,其并发症的发生并非罕见,如子痫前期（2%-17%）和血栓形成（2%-3%）。因此,探究OAPS的分子发生机制,寻找新的诊断及治疗靶点是OAPS亟待研究的方向。羟氯喹（hydroxychloroquine,HCQ）为小分子化合物,分子式为C18H26ClN3O,分子量335.87,最初用作抗疟疾药物,因其具有抗炎、免疫调节和抗血小板特性,已被广泛应用于系统性红斑狼疮（SLE）,类风湿性关节炎（RA）等自身免疫病的临床治疗。HCQ作为治疗OAPS的非一线用药,毒性低并能穿过胎盘,目前仅用于常规治疗失败的OAPS患者,合并SLE或其他全身性自身免疫病的OAPS患者以及高风险aPLs谱的患者。在山东省立医院产科难治型OAPS患者的治疗中,HCQ表现出显著疗效且副作用小的优势。基于目前关于HCQ对OAPS的治疗效果缺少一致性研究,HCQ的作用机制尚未明确,其安全性、疗效、治疗机制均存在一定争议。因此,研究HCQ对OAPS的治疗作用及机制具有一定的临床意义,能够为OAPS的治疗提供理论参考。本研究拟从临床研究,OAPS动物模型,细胞模型和生信分析四个层面来探究HCQ对OAPS所致胎盘源性病理妊娠的治疗机制,寻找HCQ治疗靶点,以期优化HCQ对OAPS的治疗方案,并寻找新的诊断治疗靶点。第一部分 HCQ治疗OAPS患者的临床特点和相关因素研究目的以临床资料分析明确HCQ在OAPS中的使用范围。对比HCQ与非HCQ治疗组妊娠结局,评估HCQ对OAPS的治疗效果并对HCQ用药安全性进行探讨。研究方法1回顾性分析2019年至2020年因抗磷脂综合征（antiphospholipid syndrome,APS）入省立医院产科住院治疗患者病历,共计117例,对入组患者基础信息行统计分析。2通过病例分析探究HCQ孕期用药安全性。3卡方检验分析HCQ组和非HCQ组妊娠结局的统计学差异。运用Logist回归分析探究混杂因素。研究结果1通过回顾性分析,对117例患者个体情况进行统计分析,可以发现HCQ倾向于被用在有不良妊娠病史和其他自身免疫病的患者中。其中,具有10周以下妊娠丢失病史的患者其中更易接受HCQ的治疗（75.3%VS57.7%,P＜0.05）。诊断为非标准OAPS患者接受HCQ治疗比例较低（1.5%VS11.5%,P＜0.05）。实验室诊断中,抗体滴度高,阳性率高更易使用HCQ治疗。HCQ与非HCQ组在LA,ACL,抗 β2GPI 抗体的比例分别为（30.8%VS23.1%,50.8%VS40.4%,46.2%VS32.7%）,同时抗体双阳性和三阳性的患者,HCQ的使用量更多（29.3%VS 19.2%,9.2%VS3.8%）。2在117例患者中,未观察到HCQ对孕妇及胎儿存在视网膜和心脏毒性。仅观察到一例患者肝功能异常,患者入院时肝酶增高,但由于其用药情况复杂,无法明确HCQ是肝损伤的直接原因。3去除合并SLE等对妊娠结局影响较大的混杂因素后,对104例患者行妊娠结局统计分析。HCQ的使用将OAPS患者活产率由87.5%提升至98.2%（P＜0.05）。尽管未见明显统计学意义,可以观察到HCQ的治疗降低了子痫前期、胎儿窘迫、羊水过少等病理妊娠结局的发生率（8.9%VS14.6%;7.1%VS10.4%;8.9%VS10.4%）。接受HCQ治疗后,羊水污染的发病率明显降低,具有明显统计学意义（P＜0.05）。第二部分 评估HCQ对OAPS小鼠模型的治疗效果研究目的建立OAPS动物模型,探究OAPS发病机制以及对胎盘发育结构的病理影响。运用HCQ治疗OAPS小鼠,评估HCQ对OAPS的治疗效果,明确HCQ对病理妊娠的防治以及对胎盘的保护作用。研究方法1运用C57BL6j小鼠,通过尾静脉注射单克隆抗磷脂抗体（aPL）,构建OAPS小鼠模型,分析其不良妊娠结局。2通过尾静脉注射HCQ治疗OAPS动物模型,分析病理妊娠结局变化情况。3取胎盘组织固定后行组织切片HE染色,行病理分析,研究HCQ对OAPS组织病理改善效果。研究结果:1通过使用aPL构建OAPS动物模型。在aPL的影响下,OAPS模型鼠能够成功拟合OAPS患者临床症状,小鼠胚胎吸收率增加至31%,流产和死胎是主要表现,同时存在胎盘血肿,胎儿生长受限等病理妊娠的风险。2通过HCQ的治疗,将OAPS鼠胚胎吸收率从31%降至6.7%,与对照组4.5%持平（P＜0.01）。同时,HCQ的治疗改善了因aPL导致的OAPS模型鼠胎儿生长受限及胎盘发育不良的问题。HCQ将OAPS模型孕鼠宫内胎鼠平均重量由345.8mg提升至445.3mg;并将胎盘重量由92.3mg提升至104.3mg（P＜0.01）。并且HCQ治疗组和对照组无统计学差异。经HCQ治疗后,小鼠见栓后未妊娠比例由32.2%降至18.2%,存在部分改善,但未能完全恢复至对照组水平（11.8%）。3据病理学分析,aPL所致胎盘损伤常发生于胎盘母胎界面近蜕膜处,存在多发大面积坏死区域合并有血管的塌陷病变等。坏死病灶呈条索状或者片状分布,常常伴有纤维素样变性,钙盐沉积,嗜酸粒细胞聚集等。胎盘血管壁变性退化脱落,血管壁增厚形成坏死灶,部分内皮细胞脱落入血管腔内。尽管HCQ无法完全防止胎盘病变的发生,但经过治疗,坏死区域有所减少,面积变小,血管病变情况较轻。病灶从原来的大片状转为点状或团块状。同时,病变血管较少,病变区域更为轻微,表现为零星的内皮细胞点状坏死。以上结果提示HCQ在体内能够有效改善OAPS的病理妊娠损伤程度。第三部分 探究HCQ治疗OAPS的作用机制研究目的利用体外细胞模型探究HCQ对aPL刺激下细胞功能的影响。探讨在aPL作用下HCQ的治疗对滋养细胞增殖、成管、侵袭、迁移的功能变化。运用生物信息学分析,研究HCQ治疗OAPS的潜在靶点,探究HCQ治疗OAPS的分子机制。研究方法1培养人绒毛外滋养细胞HTR8细胞系,以CCK8实验确定不同浓度梯度HCQ/aPL细胞毒性及增殖能力变化。2通过Transwell实验、6孔板划痕实验、小管形成实验分别检测aPL/aPL+HCQ对HTR8细胞侵袭、迁移、成管能力的影响。3下载GEO数据GSE36083数据集,行生物信息学分析OAPS致病的差异基因和通路富集分析。4以Discovery Studio软件分析目标蛋白,分子对接形式检测其与HCQ的结合位点,结合能等,以推断HCQ对OAPS治疗的分子靶点。5使用PCR和WB在细胞样本中验证多个靶分子在aPL/aPL+HCQ作用下mRNA和蛋白水平表达的变化。研究结果1高浓度aPL（≥50μg/ml）以及高浓度HCQ（≥100μg/ml）能够显著抑制滋养细胞活力,存在细胞毒性。当抗体浓度≤20μg/ml时,增殖能力在对照组90%左右。当加用HCQ治疗后,细胞增殖能力未能得到恢复。可观察到aPL能够使滋养细胞增殖降低,并存在剂量依赖性而非时间依赖性。2 aPL能影响滋养细胞血管重塑能力。经20μg/ml抗体刺激后,滋养细胞小管节点数目,网眼形成数目,网眼面积分别下降到对照组23.3%,12.7%,16%,有明显统计学意义。同时,随着抗体浓度的升高,降低程度与剂量成正比。加用HCQ治疗,OAPS至滋养细胞成管抑制作用被大部分逆转。从节点数,小管数和管腔面积三个指标可知,HCQ将抗体所致的抑制效果分别提升至对照组的78.5%、75.2%、99.1%。3 aPL能影响滋养细胞侵袭,迁移能力。aPL作用下,细胞24h迁移面积有所减少（67.8%VS 54.3%,P＜0.01）,同时侵袭能力降低,与对照组相比约59.5%的细胞未能在24h内穿至下室面。经过HCQ治疗后滋养细胞HTR8由上室穿过基质胶的细胞数较抗体组有所增加,可达90.2%,细胞穿膜比率回升。通过HCQ的治疗,滋养细胞HTR8 24h内迁移面积63.4%,恢复至对照组的94%。4由GEO数据库GSE36083数据集分析后,选取11个差异基因（P＜0.05）。将差异基因与HCQ行分子互作研究,其中6个存在HCQ结合位点,提示为HCQ治疗OAPS潜在靶点。通过PCR和WB实验验证,初步发现HCQ能够逆转在aPL刺激下 NOG、TNFSF10、CXCR4 的下调效果。提示 NOG、TNFSF10、CXCR4可能是HCQ治疗OAPS潜在靶点。研究结论1 使用HCQ治疗OAPS能够改善妊娠结局,提高活产率,降低羊水污染等妊娠并发症的发生率。2 aPL能够影响小鼠模型正常妊娠,增加死胎和流产的风险,同时胎盘发生病理性改变。HCQ能够降低不良妊娠结局发生率,改善胎盘功能。3 HCQ能够改善aPLs对滋养细胞功能的损伤,使细胞侵袭能力、迁移能力、血管重塑能力得以改善,但无法恢复滋养细胞被轻度抑制的增殖能力。4通过生物信息学分析及体外实验验证,初步发现NOG、TNFSF10、CXCR4是HCQ治疗OAPS的潜在靶点。