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背景:铅是一种广泛分布于环境中的工业重金属污染物,可通过空气、饮用水、食物和粉尘等多种途径进入人体,并遍布于人体的各个器官和组织,严重影响健康。现有证据表明铅对人体的神经系统、血液系统、心血管系统和骨骼系统均可造成损伤,尤其是对中枢和外周神经系统特定神经结构有不可逆的损伤作用。铅暴露对婴幼儿的影响更大,与儿童智力发育缺陷、认知行为功能障碍、学校成绩欠佳和行为问题相关。因此,如何有效地控制铅暴露对神经系统的损伤作用以及探究其神经毒性机制一直是公共卫生领域的研究热点之一。目前认为铅神经毒性机制与神经细胞损伤、氧化应激、离子通道受损、神经递质紊乱以及血脑屏障功能受损有关。神经胶质细胞约占脑组织细胞的90%,是神经系统的支持细胞,在髓鞘构成、神经细胞发育和神经组织损伤修复过程中发挥不可替代作用。星形胶质细胞作为神经胶质细胞中的一大类细胞,其数量是神经元的数倍,它可分泌多种神经因子影响神经元的发育、迁移、突触形成、递质传递的调节以及内环境稳定。研究证据表明星形胶质细胞对铅的敏感性远远高于神经元,它可主动结合并储存铅,从而减少神经元和其他敏感细胞的铅暴露。然而,星形胶质细胞的过度活化以及释放大量的炎性因子,又会进一步加重神经炎症和神经元功能障碍。此外,铅还可直接损伤星形胶质细胞,从而损伤内皮细胞,破坏血脑屏障,损伤脑功能。自噬通常被认为是一种代偿性的保护效应,对维持细胞稳态和细胞器的更新具有重要作用。在神经系统中,自噬体对神经元内受损细胞器或蛋白分子的降解有利于维持细胞的稳态,但当自噬水平超过某一阈值,会诱导神经炎症反应和氧化应激,触发神经元自噬性细胞死亡。有研究表明铅暴露可增强神经元的自噬过程,但这种自噬对神经元起保护作用还是加剧神经元死亡还不清楚。目前国内外尚未见有关星形胶质细胞自噬与铅诱导神经毒性方面的研究。本研究分别从体内及体外两个水平验证铅暴露对星形胶质细胞自噬的影响,探讨铅暴露对星形胶质细胞自噬的作用机制以及自噬与神经炎症反应和氧化应激之间的相互作用。研究方法:1.铅暴露模型构建:选取24只健康清洁级雄性Sprague Dawley（SD）大鼠随机分为4组:正常对照组、醋酸铅暴露组、3-甲基腺嘌呤（3-MA）组和醋酸铅+3-MA组。对照组和3-MA组给予正常饮水,醋酸铅暴露组和醋酸铅+3-MA组给予的饮用水含300 ppm醋酸铅,持续饲养30天;3-MA组和醋酸铅+3-MA组大鼠额外使用10 mg/kg的3-MA进行腹腔注射,隔天注射1次,共注射15次,其余两组大鼠注射等体积生理盐水。2.铅暴露神经毒性评价:Morris水迷宫实验检测铅暴露对大鼠空间学习记忆能力的影响;苏木素-伊红（Hematoxylin-eosin staining,H＆E）染色观察各组大鼠海马和全脑组织病理变化;脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（Td T-mediated d UTP Nick-End Labeling,TUNEL）染色法检测大鼠海马组织中神经元的凋亡情况;试剂盒检测海马组织中超氧化物岐化酶（Superoxide dismutase,SOD）和过氧化氢酶（Catalase,CAT）活性;试剂盒检测海马组织中谷胱甘肽（Glutathione,GSH）和丙二醛（Malondialdehyde,MDA）水平。3.铅暴露对大鼠海马组织自噬的影响:免疫印迹（Western blotting）检测各组大鼠海马组织中自噬相关蛋白LC3-I、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p62、Akt、p-Akt Ser473、m TOR和p-m TORSer2448的蛋白表达水平;免疫荧光（Immunofluorescence,IF）检测海马组织LC3和星形胶质细胞特异性标志物胶质纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein,GFAP）表达水平以及共定位情况。4.铅暴露对星形胶质细胞自噬的影响:从出生1天的SD大鼠海马中分离星形胶质细胞并进行原代培养,通过IF检测GFAP对星形胶质细胞进行鉴定;CCK-8法检测不同浓度醋酸铅暴露星形胶质细胞的存活率;透射电镜观察星形胶质细胞自噬体的形成情况;Western blotting检测星形胶质细胞中LC3-I、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p62、Akt、p-Akt Ser473、m TOR、p-m TORSer2448、p70S6K和p-p70S6K的蛋白表达水平。5.铅暴露对星形胶质细胞炎性因子和氧化应激影响:酶联免疫吸附测定试剂盒（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测细胞上清中白介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）、肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factorα,TNF-α）和髓过氧化物酶（Myeloperoxidase,MPO）水平;试剂盒检测细胞内MDA含量。6.数据分析:用Graphpad Prism 8.0进行数据分析,采用非配对t检验分析两组间的差异,采用单因素方差分析进行多组间的统计学比较,组间两两比较采用Tukey法,以P＜0.05作为差异有统计学意义的判定标准。结果:1.铅暴露对SD大鼠的神经毒性:Morris水迷宫实验结果表明:醋酸铅暴露组SD大鼠空间学习记忆能力明显下降,水迷宫中寻找平台的潜伏期延长、平台穿越次数和在目标象限的平均时间减少,而醋酸铅+3-MA组这些行为均有改善;H＆E染色结果显示:对照组神经元排列紧密,无明显的病理改变,而醋酸铅暴露组神经元内出现核固缩甚至凋亡现象,核膜界限模糊,醋酸铅+3-MA组凋亡的神经元数目减少,细胞核大小恢复均一;TUNEL检测结果表明:与正常对照组相比,铅暴露能明显增加海马组织中神经元凋亡数目,而添加3-MA处理则显著减少神经元凋亡（均P＜0.05）。2.铅暴露对SD大鼠海马组织氧化应激指标的影响:与对照组相比,醋酸铅暴露组大鼠海马组织中SOD、CAT活性和GSH水平明显降低,而MDA水平升高;但醋酸铅+3-MA组SOD、CAT活性和GSH水平则有所上升,而MDA水平下降（均P＜0.01）。3.铅暴露对SD大鼠海马组织自噬的影响:Western blotting结果表明:与对照组相比,醋酸铅暴露组自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1表达水平明显增加,而p62水平明显下调,3-MA可部分逆转醋酸铅暴露对LC3-Ⅱ、Beclin-1和p62水平的影响;铅暴露可明显减低p-AktSer473和p-m TORSer2448水平,通过抑制Akt/m TOR通路诱导自噬;IF结果显示:醋酸铅暴露后海马组织LC3与GFAP表达明显增加且存在共定位（均P＜0.05）。4.铅暴露对星形胶质细胞自噬流的影响:IF结果显示从海马组织分离并培养的星形胶质细胞GFAP阳性率＞98%;透射电镜结果表明:与对照组相比,铅暴露可明显增加细胞中自噬体的形成,且具有剂量依赖性;Western blotting结果显示铅暴露明显增加星形胶质细胞LC3-Ⅱ和Beclin-1表达水平,降低p62、p-AktSer473、p-m TORSer2448和p-p70S6K水平,且呈剂量依赖性（均P＜0.01）。5.铅暴露对星形胶质细胞炎性因子和氧化应激因子的影响:结果表明:与对照组相比,铅暴露能明显增加TNF-α、IL-1β、MPO和MDA水平,3-MA能明显减少铅暴露诱导的TNF-α、IL-1β、MPO和MDA增加,而Akt/m TOR通路抑制剂雷帕霉素进一步增强铅暴露诱导的TNF-α、IL-1β、MPO和MDA水平上调（均P＜0.01）。结论:1.铅暴露诱导大鼠海马组织自噬,引发氧化应激和星形胶质细胞活化,促进海马神经元损伤和凋亡,从而导致大鼠空间学习记忆能力下降;抑制自噬可减轻铅暴露大鼠的神经损伤。2.铅暴露可促进海马星形胶质细胞自噬流,增加自噬水平,加重炎症反应和氧化应激,诱导神经毒性;铅暴露引起星形胶质细胞自噬可能与Akt/m TOR信号通路的负向调节有关,抑制自噬可有效缓解铅暴露神经毒性。