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研究背景和目的糖尿病（Diabetes mellitus,DM）创面属于难治性创面中极为常见的一种,乃世界性难题。脂肪来源干细胞（Adipose-derived stem cells,ADSCs）是来源于脂肪组织的多能间充质干细胞,可参与多种组织及器官的修复,在干细胞移植治疗的临床应用中具有很大的潜力。ADSCs可以趋化聚集至皮肤创面,并多向分化为皮肤附件组织、新生血管、角质形成细胞等细胞类型修复创面。ADSCs的生物学特性是影响干细胞治疗成功与否的关键因素之一。已证实DM影响ADSCs的性质和功能,但目前还没有DM病程对ADSCs生物学特性的影响,以及ADSCs应用于DM创面的功能变化的相关研究。1型糖尿病（Type 1 Diabetes mellitus,T1DM）通常出现在儿童或青少年,随着病程进展,多种组织器官常发生严重改变。分离不同病程T1DM和正常SD大鼠附睾脂肪,体外组织学上比较各组脂肪组织形态变化;提取不同T1DM病程大鼠的ADSCs,分析细胞形态,明确各组增殖、凋亡及促血管生成因子生物学特性的改变及机制,为深入了解T1DM病程对ADSCs特性的影响和机制研究提供更为丰富的信息;体内对比研究各组ADSCs多点多次移植于DM创面后的愈合情况,探讨T1DM病程是否影响ADSCs的促进DM创面愈合能力,并进行机制研究,为后期不同DM病程患者ADSCs自体移植治疗DM创面提供实验依据。方法1、建立T1DM大鼠模型。取建模后病程分别为0、4、8、12、16周的实验组SD大鼠,另取分别与实验组各组同龄的正常SD大鼠。1)获取实验组与对照组大鼠附睾脂肪组织,油红O染色观察各组脂肪细胞组织形态学变化。2)细胞增殖及相关机制研究从各组附睾脂肪组织提取ADSCs,培养至第三代用于实验研究,CCK-8检测细胞增殖变化,进行细胞周期分析,Real-time PCR检测各组ADSCs周期调控相关基因P21及细胞增殖基因C-JUN、C-FOS mRNA的表达变化,探索不同T1DM病程致使ADSCs出现细胞增殖变化的机制。3)细胞凋亡及相关机制研究从各组脂肪组织中提取ADSCs,培养至第三代,TUNEL法检测细胞凋亡,Real-time PCR检测ADSCs凋亡调控相关基因caspase-8、NFKB、Bcl-2的表达变化,探索不同T1DM病程致使ADSCs出现细胞凋亡变化的机制。4)血管生成因子研究免疫荧光和Real-time PCR检测ADSCs中促血管生成因子VEGF、bFGF表达,探索不同T1DM病程对ADSCs血管生成能力的影响。2、建立T1DM大鼠背部创面模型,将来源于不同T1DM病程大鼠的ADSCs分别多点多次注射于大鼠背部创面周围和基底组织,计算创面愈合率;分别于注射后第7、14天分批处死大鼠后切取创面组织,Real-time PCR和免疫荧光检测创面组织促血管生成因子表达变化,探讨T1DM病程影响ADSCs促创面愈合的机制。结果1、油红O染色显示:随着T1DM病程的发展,发生了脂肪组织中脂肪细胞体积缩小和数量增加,形态扭曲,细胞内脂滴变小。2.胶原酶消化法成功从T1DM和正常对照组SD大鼠附睾脂肪组织中分离出ADSCs,CCK-8显示其增殖于成模后4周开始减慢,且随着病程的延长其增殖逐渐减慢;从细胞周期角度分析,处于S期细胞比例,自从成模后4周开始显著下降,周期调控相关基因P21开始逐渐上升,细胞增殖相关基因C-JUN、C-FOS表达此时开始逐渐降低。提示从成模4周后开始,ADSCs可能发生了细胞周期阻滞,由G1期进入S期速率减慢,细胞增殖相关基因也发生了改变。3.TUNEL显示:ADSCs凋亡于成模后4周开始加速,且随着T1DM病程的延长其凋亡逐渐加快;凋亡调控基因caspase-8表达从成模4周后开始逐渐上升,NFKB、Bcl-2表达从成模4周后开始逐渐下降。4.Real-time PCR和免疫荧光显示ADSCs中VEGF、bFGF表达于成模后8周开始下降,且随着病程延长VEGF、bFGF表达持续下降。5.成功建立T1DM SD大鼠背部皮肤创面模型,分别计算ADSCs移植于创面后第4、7、14天创面愈合率。注射T1DM病程为0、4、8、12周组大鼠ADSCs于T1DM大鼠背部创面,均可有效促进创面愈合,但促进作用逐渐减弱,而16周组未见明显疗效。免疫荧光和Real-time PCR显示,注射T1DM病程为0、4、8、12周组大鼠ADSCs于T1DM大鼠背部创面,创面组织中促血管生成因子均有明显升高,但呈逐渐下降的过程,而16周组未见明显改变。结论1、T1DM大鼠模型的附睾脂肪组织细胞随着T1DM病程的延长而发生病理形态学改变。2、T1DM成模后早期即第4周时即可发生ADSCs的增殖减慢,且随着DM病程的延长,增殖继续减慢。其增殖减慢可能与随着糖尿病病程的延长,细胞周期阻滞逐渐加重,增殖相关基因C-JUN、C-FOS表达下降相关。3、T1DM成模后早期即第4周时即可发生ADSCs的凋亡加速,且随着DM病程的延长,凋亡继续加速,其凋亡加速与凋亡相关基因caspase-8的表达上升及NFKB、Bcl-2表达下降相关。4、ADSCs促血管生成因子的表达在T1DM成模后中期即第8周时开始下降,并随着病程的延长而持续下降。5、不同T1DM病程大鼠ADSCs促创面愈合能力发生改变,但在成模16周前仍然保留了部分促进创面愈合能力。其机制可能与其促进创面血管化的功能受损相关。