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背景和目的食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）是食管癌最主要的病理学类型,约占食管癌的90%左右,是一种具有多种病因的复杂疾病,其诊断时往往是晚期,并且容易出现治疗耐药、转移和复发。尽管包括外科手术、化学疗法、放射疗法在内的多学科治疗方法已被广泛应用于ESCC的治疗,但ESCC患者的五年生存率仍然不到20%。传统疗法对ESCC的有限作用需要我们发现ESCC发生发展过程中新的作用机制,将其作为靶点应用于ESCC的诊断和治疗。极光激酶A（Aurora kinase A,AURKA）属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族,在调节细胞的有丝分裂过程中起着重要作用。作为一种蛋白激酶,AURKA通过磷酸化底物蛋白来调节底物蛋白的功能。更重要的是,AURKA作为癌基因在肿瘤形成中起着重要的作用,促进多种类型的肿瘤发生。目前,很多AURKA特异性抑制剂或者针对整个Aurora激酶家族的抑制剂已经被研发出来,一部分已经进入临床试验,特别是AURKA特异性的抑制剂Alisertib已经进入三期临床试验阶段,说明AURKA很有研究的价值和意义。在ESCC中,有文献报道AURKA在ESCC患者癌组织表达升高,并且AURKA的表达和患者预后不良相关。功能上,AURKA能促进ESCC细胞的增殖和侵袭迁移能力。尽管AURKA在ESCC中高表达并且具有促癌作用,但是AURKA的作用机制特别是AURKA在ESCC中的底物蛋白研究甚少,这些研究的不足阻碍了 AURKA抑制剂在ESCC中的进一步应用。本课题中,我们通过His-pull down和液相质谱分析技术筛选并验证多聚糖结合蛋白（Syndecan binding protein,SDCBP）作为ESCC中AURKA的底物蛋白,并进一步研究了AURKA对SDCBP的调节作用及调节机制。SDCBP是一种含有PDZ结构域的支架蛋白,通过介导蛋白之间的相互作用来调节下游通路和细胞的功能。尽管SDCBP在多种癌症中通过促进细胞增殖、侵袭转移、调控干细胞特性、促进血管生成来发挥其促癌作用,但是SDCBP在ESCC中的作用及其机制还没有文献报道。本研究通过His-pull down和液相质谱分析技术筛选并验证了 SDCBP是ESCC中AURKA的底物蛋白,并进一步探索SDCBP在ESCC中的表达和功能,以及SDCBP的下游信号通路,证明SDCBP作为AURKA下游的底物蛋白是有功能的,进而证明ESCC中靶向AURKA-SDCBP这个轴是有研究的价值和必要的。以上述研究背景和研究思路为依托,本课题分为以下四个部分进行探讨:1)筛选SDCBP作为ESCC中AURKA的下游底物蛋白;2)探讨AURKA对SDCBP的磷酸化修饰以及对其蛋白稳定性的影响;3)研究SDCBP在ESCC中的表达和功能;4)研究ESCC中SDCBP下游的信号通路。方法1.筛选ESCC中AURKA的底物蛋白用NI-NTA beads在原核表达系统纯化AURKA蛋白,通过His-pull down实验和液相质谱技术分析鉴定ESCC细胞中能和AURKA相互作用的蛋白。用David数据库对这些蛋白进行功能富集。通过内源性免疫共沉淀实验验证质谱结果中可能和AURKA相互作用的蛋白。通过内源性和外源性免疫共沉淀实验验证AURKA和SDCBP的结合能力。用Western blot方法和免疫组织化学方法检测AURKA和SDCBP在ESCC细胞系和患者组织的表达相关性。2.探索AURKA对SDCBP的磷酸化修饰用NI-NTA beads在原核表达系统纯化SDCBP蛋白,通过体外蛋白激酶实验检测AURKA能否磷酸化SDCBP。通过Netphos2.0网站和AURKA底物共有的磷酸化序列特征预测SDCBP可能的磷酸化位点。构建这些磷酸化位点失活突变的SDCBP质粒并克隆到pet28a载体上,用NI-NTA beads在原核表达系统纯化SDCBP磷酸化位点失活突变的蛋白。通过体外蛋白激酶实验检测和野生型SDCBP蛋白相比,AURKA对磷酸化位点失活突变的SDCBP蛋白的磷酸化情况。3.研究AURKA对SDCBP蛋白的调节机制通过荧光定量PCR和Western blot检测AURKA敲低或过表达后SDCBP的mRNA和蛋白水平的变化。通过Western blot检测蛋白合成抑制剂亚胺环已酮（cycloheximide,CHX）处理后AURKA对SDCBP蛋白稳定性的影响,以及SDCBP的Ser131和Thr200位点的磷酸化对SDCBP蛋白稳定性的影响。通过免疫共沉淀实验检测AURKA对SDCBP蛋白泛素化的影响,以及SDCBP的Ser131和Thr200位点的磷酸化对SDCBP蛋白泛素化的影响。4.研究ESCC中SDCBP的表达和功能通过免疫组织化学方法检测SDCBP在ESCC患者癌组织和癌旁组织的表达差异,分析SDCBP在癌组织的表达和患者临床病理资料的相关性。通过MTT、软琼脂克隆形成实验检测敲低或者过表达SDCBP后,或者SDCBP的Ser131和Thr200位点磷酸化失活后,ESCC细胞的增殖和克隆形成。通过细胞移植瘤模型（cell derived xenograft,CDX）研究敲低SDCBP后肿瘤的生长情况。通过挽救实验检测SDCBP是否是AURKA功能性的下游分子。5.研究ESCC中SDCBP促进细胞增殖的作用机制通过Western blot检测敲低SDCBP后,或者SDCBP的Ser131和Thr200位点磷酸化失活后,p-EGFR、p-PI3K、p-Akt的表达。通过内源性和外源性免疫共沉淀实验验证SDCBP和EGFR的结合能力。通过免疫荧光和流式细胞技术检测SDCBP敲低后,或者SDCBP的Ser131和Thr200位点磷酸化失活后,EGFR的膜定位变化情况。人源肿瘤移植瘤（patient derived xenograft,PDX）动物模型验证SDCBP调控EGFR/PI3K/Akt信号通路。结果1.AURKA的互作蛋白和乙酰化、RNA结合、磷酸化、甲基化相关。在筛选验证后,SDCBP有可能作为ESCC中AURKA的下游底物蛋白。AURKA和SDCBP在ESCC细胞和293T细胞中相互结合,AURKA能够结合SDCBP的PDZ1结构域而不结合PDZ2结构域。AURKA和SDCBP在ESCC细胞系和患者癌组织的表达呈正相关。2.体外激酶实验中AURKA能够直接磷酸化SDCBP。根据网站预测和AURKA底物共有的磷酸化序列特征预测SDCBP的Ser87、Ser131和Thr200三个位点可能被AURKA磷酸化。Ser87、Ser131和Thr200三个单位点磷酸化失活突变后,只有Ser131和Thr200单位点磷酸化失活突变后SDCBP的磷酸化水平降低,说明SDCBP在Ser131和Thr200位点被AURKA磷酸化。进一步将Ser131和Thr200双位点失活突变后,SDCBP的磷酸化水平下降更明显。3.AURKA敲低后SDCBP蛋白表达降低而mRNA水平没有变化,AURKA过表达后SDCBP蛋白水平升高而mRNA水平没有变化。CHX处理后,敲低AURKA促进SDCBP的降解,过表达AURKA则抑制SDCBP的降解。敲低AURKA促进SDCBP的泛素化。在对SDCBP磷酸化如何影响其蛋白稳定性的研究中,结果表明SDCBP磷酸化位点失活后,会促进CHX引起的SDCBP的降解,升高SDCBP的泛素化水平。4.SDCBP在ESCC患者癌组织中表达升高,SDCBP的高表达和更晚的临床分期相关,预示着患者预后不良。SDCBP敲低后ESCC细胞的增殖能力降低,克隆形成减少,SDCBP过表达后ESCC细胞的增殖和克隆形成能力增加。SDCBP的Ser131和Thr200位点的磷酸化失活后,细胞的增殖能力和克隆形成能力降低。敲低SDCBP后,细胞来源的小鼠移植瘤生长明显减慢。SDCBP过表达能够挽救AURKA敲低后引起的增殖抑制,说明SDCBP是AURKA功能性的下游分子。5.在ESCC细胞中敲低SDCBP后,或者SDCBP的Ser131和Thr200位点磷酸化失活后,p-EGFR、p-PI3K、p-Akt的表达水平降低。SDCBP和EGFR相互结合,EGFR能结合SDCBP的PDZ2结构域。敲低SDCBP后,或者SDCBP的Ser131和Thr200位点磷酸化失活后,EGFR在细胞膜上的定位变少。PDX动物模型结果显示,敲低SDCBP能通过EGFR/PI3K/Akt通路抑制ESCC肿瘤生长。结论ESCC中高表达的SDCBP通过在Ser131和Thr200位点被AURKA磷酸化来维持其蛋白稳定性、促进ESCC细胞增殖的特性以及对EGFR/PI3K/Akt信号通路的活化。靶向AURKA-SDCBP-EGFR轴有望为ESCC的治疗提供新的理论依据。