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背景和目的:食管癌是我国目前最常见恶性肿瘤之一,其主要病理类型为鳞癌,虽然近年来食管鳞状细胞癌（ESCC）的诊疗技术逐步提高,但患者总体治疗效果欠佳,总生存期仍较短,而目前ESCC发生发展的分子机制仍未完全阐明。长链非编码RNA（LncRNA）异常表达与ESCC等多种恶性肿瘤密切相关,其中长链非编码RNA X染色体失活特异性转录本基因（LncRNA XIST）在食管癌发生及发展过程可能发挥癌基因作用,但其在ESCC发生及发展进程中的具体作用机制仍未完全明确。因此,本研究拟探讨LncRNA XIST调控ESCC发生发展过程的作用机制,并进一步分析其与微小RNA-129-5p（miR-129-5p）/细胞周期蛋白D1（CCND1）在ESCC发生及发展过程中的作用关系,以期揭示ESCC部分发病机制,有助于指导临床制定ESCC的治疗方案。本课题包括以下三部分:第一部分:si-XIST抑制ESCC细胞的生长;第二部分:XIST/miR-129-5p调控ESCC细胞生长进程的机制研究;第三部分:XIST通过调控miR-129-5p调控CCND1的表达。第一部分si-XIST抑制ESCC细胞的生长方法:选取2013年5月至2013年12月收治的42例食管鳞癌患者为食管癌组,所有研究对象均于术中留存食管癌组织及癌旁组织标本。采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测LncRNA XIST在食管癌组织及癌旁组织中的表达水平,根据检测结果将LncRNA XIST分为高表达组（23例）与低表达组（19例）,同时收集食管癌患者临床病理资料,比较LncRNA XIST表达与患者临床病理特征的关系。所有患者均进行5年随访,Kaplan-Meier法分析LncRNA XIST表达与患者预后的关系。体外培养人食管上皮细胞Het-1A与食管鳞癌细胞株EC9706、KYSE510、KYSE450、Eca-109,qRT-PCR法检测不同细胞中XIST的表达情况。采用脂质体转染技术分别将si-NC、si-XIST转染至食管鳞癌EC9706、Eca-109细胞。转染后各组细胞增殖活性采用MTT实验检测;转染后各组细胞周期变化采用流式细胞周期技术检测;Transwell细胞实验检测转染后各组细胞迁移及侵袭能力改变;Annexin V-FITC/PI双染技术检测转染后各组细胞凋亡情况。结果:与癌旁组织比较,食管癌组织中LncRNA XIST的表达水平显著升高（P＜0.001）;XIST表达与食管癌患者临床分期呈正相关;XIST低表达组食管癌患者生存率显著高于高表达组患者生存率（P＜0.05）;与Het-1A细胞比较,食管癌细胞EC9706、KYSE510、KYSE450、Eca-109中XIST的表达水平均显著升高（P＜0.01）,XIST在食管癌EC9706、Eca-109中的表达水平增加趋势较为显著,因此后续实验中选取EC9706、Eca-109细胞为研究材料;食管癌EC9706、Eca-109细胞中转染si-XIST后XIST的表达水平较转染si-NC显著降低（P＜0.05）;与si-NC组比较,si-XIST组细胞增殖能力显著降低（P＜0.05）,G0/G1期细胞比例明显升高,而S期细胞比例明显降低,细胞迁移数及侵袭数均显著减少（P＜0.05）,细胞凋亡率均显著升高（P＜0.05）。结论:XIST在食管鳞癌组织及细胞中均呈高表达,其高表达量与患者临床病理特征及预后有关,沉默XIST表达可抑制食管癌细胞增殖、迁移及侵袭并诱导细胞凋亡进而抑制食管鳞癌发展进程。第二部分XIST/miR-129-5p调控ESCC细胞生长进程的机制研究方法:食管鳞癌EC9706、Eca-109细胞转染miR-NC、miR-129-5p mimics,分别为miR-NC组、miR-129-5p组;转染空载质粒（Vector组）与XIST过表达质粒（XIST组）;si-XIST与anti-miR-NC共转染入食管鳞癌EC9706、Eca-109细胞（si-XIST+anti-miR-NC组）,si-XIST与anti-miR-129-5p共转染入食管鳞癌EC9706、Eca-109细胞（si-XIST+anti-miR-129-5p组）。双荧光素酶报告实验验证XIST与miR-129-5p的靶向关系;RIP实验验证XIST与miR-129-5p的靶向结合关系;qRT-PCR实验检测食管癌组织及不同细胞系中miR-129-5p的表达水平,Kaplan-Meier法分析miR-129-5p表达与患者预后的关系,Pearson法分析ESCC组织中miR-129-5p与XIST表达水平的相关性。MTT实验、Transwell实验分别检测各组细胞增殖、迁移及侵袭能力;流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期变化。结果:荧光素酶报告实验证明XIST可结合miR-129-5p并调控其活性;RIP实验证明内源性XIST可直接靶向结合miR-129-5p。与癌旁正常组织比较,食管癌组织中miR-129-5p的表达水平明显降低（P＜0.01）;Pearson法分析显示miR-129-5p与XIST呈明显负相关关系（P＜0.05）;miR-129-5p高表达组食管癌患者总生存率显著高于miR-129-5p低表达组患者总生存率（P＜0.05）;与Het-1A细胞比较,不同食管鳞癌细胞中miR-129-5p的表达水平均显著降低（P＜0.05）;与Vector组比较,XIST组miR-129-5p的表达水平均显著降低（P＜0.05）;与si-NC组比较,si-XIST组miR-129-5p的表达水平均显著升高（P＜0.05）;与miR-NC组比较,miR-129-5p组细胞增殖活性均显著降低（P＜0.05）,G0/G1细胞期细胞比例明显升高,相比较下S细胞期细胞比例降低明显,细胞迁移及侵袭数均显著减少（P＜0.05）,细胞凋亡率均显著升高（P＜0.05）;与si-XIST+anti-miR-NC组比较,si-XIST+anti-miR-129-5p组细胞增殖活性随着培养时间的延长而显著增强（P＜0.05）,G0/G1期细胞比例明显降低,S期细胞比例明显升高,细胞迁移及侵袭数均显著增加（P＜0.05）,细胞凋亡率均显著降低（P＜0.05）。结论:在食管癌组织及细胞中miR-129-5p均呈低表达,上调miR-129-5p表达可抑制食管癌发生发展进程,沉默XIST可通过上调miR-129-5p表达进而抑制食管癌发展进程。第三部分XIST通过调控miR-129-5p调控CCND1的表达方法:将si-XIST分别与anti-miR-NC、anti-miR-129-5p共转染入食管鳞癌EC9706、Eca-109细胞分别为si-XIST+anti-miR-NC组、si-XIST+anti-miR-129-5p组;将XIST过表达质粒与miR-NC、miR-129-5p mimics分别共转染入食管鳞癌EC9706、Eca-109细胞分别为XIST+miR-NC组、XIST+miR-129-5p组。双荧光素酶报告实验与RIP实验验证miR-129-5p与CCND1的靶向结合关系。qRT-PCR实验检测食管癌组织及细胞中CCND1 mRNA的表达水平;采用Pearson法分析CCND1mRNA、XIST及miR-129-5p表达水平的相关性。蛋白免疫印迹（Western blot）实验检测CCND1、XIST及miR-129-5p之间的调控关系。构建sh-XIST过表达载体,将其转染入食管鳞癌EC9706细胞,并将其注射入裸鼠右侧腋窝皮下进行裸鼠移植瘤实验,测量移植瘤体积及重量。采用Western blot与qRT-PCR实验分别检测移植瘤中CCND1、XIST及miR-129-5p的表达。结果:双荧光素酶报告实验与RIP实验证明CCND1是miR-129-5p的靶点,miR-129-5p可结合CCND1。CCND1在食管癌组织中的表达水平与癌旁正常组织相比显著升高（P＜0.05）,相较于正常食管上皮细胞Het-1A,ESCC细胞中CCND1的表达水平均显著升高（P＜0.05）。CCND1 mRNA与miR-129-5p的表达水平呈负相关（P＜0.05）,而与XIST表达水平呈正相关（P＜0.05）。XIST可通过负向调控miR-129-5p表达进而正向调控CCND1的表达;与sh-NC组比较,sh-XIST组裸鼠移植瘤体积显著减小（P＜0.05）,移植瘤重量显著减少（P＜0.05）,裸鼠移植瘤中XIST的表达水平显著降低（P＜0.05）,miR-129-5p的表达水平显著升高（P＜0.05）,而CCND1蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。结论:沉默XIST后可通过调控miR-129-5p/CCND1轴进而抑制食管鳞癌体内移植瘤生长。