腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus,AAV）是一种小型无膜包被的单链DNA病毒,具有复制缺陷性,通常需要腺病毒或疱疹病毒等辅助病毒（helper virus）存在时,才能完成复制过程。目前,在临床上作为最有前景的基因治疗载体,主要是由于其免疫原性低、不具有致病性,长时稳定表达等许多优点。反向末端重复序列（Inverted terminal repeats,ITRs）位于AAV基因组的两端,由20个核苷酸的D序列和125个核苷酸的T型发卡回文结构组成,是AAV基因组中唯一的顺式作用元件,在重组腺相关病毒（Recombinant adeno-associated virus,r AAV）基因组复制和包装中起着非常重要的作用。虽然ITR是r AAV包装过程中不可或缺的结构,但ITR非常不稳定。通常在使用一些常规的大肠杆菌进行质粒扩增过程中,r AAV载体质粒中的一侧或两侧ITR经常发生突变缺失,并影响病毒的包装和转导效率。因此,筛选能维持ITR稳定性的菌株,优化r AAV载体质粒的生产工艺以降低ITR突变机率,对提高r AAV基因组的完整性和包装产量非常有必要。为了筛选有利于维持ITR稳定性的菌株,首先分别使用4种不同的大肠杆菌菌株（DH5α、TOP10和SURE及Trans Stbl3）扩增r AAV载体质粒p WT08169。根据ITR内不同的酶切位点对质粒DNA进行限制性酶切分析,通过比较发现用不同菌株生产的载体质粒中ITR缺失区段和突变率均不同,其中SURE菌株最有利于维持ITR稳定性,其次是Trans Stbl3菌株。接下来,探究r AAV载体质粒生产工艺参数与ITR稳定性的关系。一方面,通过删除r AAV载体质粒中下游ITR外侧的C-G tails显著提高了ITR稳定性。另一方面,分别从转化菌株的培养温度、培养时间及传代次数进行分析研究,结果显示当转化菌株培养温度为37℃时可降低ITR突变率,且在培养时间为20 h时提取的质粒DNA浓度最高;同时发现转化菌株传代次数越多,r AAV载体质粒中ITR越不稳定,突变率越高。最后,使用不同工艺生产的载体质粒转染HEK293细胞,探究ITR稳定性对r AAV载体包装和转导的影响。比较含有完整ITR和缺失ITR的r AAV基因组物理滴度,发现含有完整ITR的r AAV包装产量明显高于缺失下游ITR的rAAV。然后,分别用不同ITR类型的r AAV感染Hela细胞,发现缺失下游ITR的r AAV感染细胞的能力低于含有完整ITR的r AAV,结果表明r AAV载体质粒中下游ITR发生突变缺失会降低r AAV的包装效果和体外表达水平。