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目的1.鉴定新疆地区分离的布鲁氏菌的生物型,确定AMOS-PCR在鉴定布鲁氏菌生物型水平上的能力。2.鉴定新疆地区分离的布鲁氏菌的基因型,确定多位点可变数目串联重复序列分析（MLVA）法在布鲁氏菌基因型水平上的鉴定和鉴别能力。3.对PCR产物测序后进行聚类分析,绘制遗传进化树,合并汇总多个独立研究的结果,与全球数据库对比后分析近年布鲁氏菌近年流行生物型、基因型的变化情况。4.对布鲁氏菌病患者的临床特点及不同靶器官损害进行统计分析,分析其与布鲁氏菌种属及基因型有无相关性。方法1.血培养阳性患者的布鲁氏菌菌株的分离培养以及鉴定生物型。于石河子大学第一附属医院感染科确诊为布鲁氏菌病的70例患者中选取血培养布鲁氏菌阳性的26例患者,分离培养其菌株,按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书,提取上述细菌的基因组DNA,-20℃保存备用。2.通过AMOS-PCR鉴定菌株生物型。患者血培养阳性的产物,经分菌保存后,送至石河子大学动物科技学院生物实验室。根据文献,以布鲁氏菌属IS711插入序列为基础设计AMOS-PCR引物。引物由上海生物工程公司合成。反应体系（25.0ul）:10xbuffer（Mg2+）2.5μL,d NTP2.0μL,Taq DNA聚合酶0.8μL,引物IS711 1.0μL,引物A、M、O、S各0.4μL,模版DNA2.0μL,dd H2O补至25.0μL。反应的条件为:首先设反应温度为95°C预变性5分钟后,55°C退火1分钟,继续在72°C的温度下延伸3分钟,循环35次,最后在72°C温度下延伸10分钟。对于PCR产物可保存于4℃冰箱,后续通过2%琼脂糖凝胶电泳分离扩增的DNA片段。3.通过MLVA测序结果鉴定菌株的基因型。经AMOS-PCR鉴定为布鲁氏菌的血培养阳性产物,在石河子大学动物科技学院生物实验室提取布鲁氏菌DNA,选取16个数目可变串联重复序列位点（VNTR）进行PCR扩增,根据文献设计16对引物,引物序列及PCR扩增条件见文献[7,8]。16个引物分为两组即Pane1和Pane2。Pane1标记其中的8个引物:Bruce06、Bruce08、Bruce11、Bruce12、Bruce42、Bruce43、Bruce45和Bruce55,而Pane2标记分为两组,Pane2A包括Bruce18、Bruce19和Bruce21,Pane2B包括Bruce04、Bruce07、Bruce09、Bruce16和Bruce30。扩增体系:Premix Taq 10.0μL,正、反向引物（10μL/L）各0.4μL,DNA模板0.5μL,用灭菌蒸馏水补至20.0μL。反应的条件为:首先设反应温度为96℃预变性4分钟后,50℃退火40秒,继续在72℃的温度下延伸3分钟,循环35次;最后在72°C温度下延伸5分钟。PCR的产物通过2%琼脂糖凝胶进行电泳分析,然后可保存于-20℃冰箱,后续由上海生工公司进行序列测定,测序后的基因序列通过DNAMAN、Mega等软件进行分析后分析结果送往中国疾控实验室通过Bionumerics6.6、Splits Tree等软件进行分析聚类,绘制遗传进化树,在网页http://mlva.u-psud.fr/MLVA net上输入已经计算好的16个位点的串联重复数值,与数据库中已经发表确定了的基因序列进行比较,确定布鲁氏菌基因的序列型和MLVA基因型。4.收集临床病人的症状、诊断、检查检验等相关临床信息。于石河子大学第一附属医院病案统计科收集相关病人的临床信息后,进行数据分析,统计一般症状的百分率、检验检查异常的百分率、不同系统病发症发病率的之间差异,治疗方案以及疗效。结果1.经AMOS-PCR鉴定此26例血培养阳性物均为羊型布鲁氏菌。2.MLVA测序结果进一步证实,此26例血培养阳性物均为羊3型布鲁氏菌,MLVA16基因型为42型。3.26例患者中均有明确的流行病学史;发病以4-8月份为主;所有患者均有发热表现,其次为头晕、头痛,消化系统症状,多汗,腰背痛,关节痛等。26例患者中,1例患者并发胸腔积液、心包积液,另1例患者并发胸腔积液、盆腔积液、腹腔积液;另有2例患者仅出现腹腔积液。其中,26例患者中,肝功能异常（≥2×ULN）的患者有6例;血清肌酐降低的患者有13例。4.此26例患者中,除了3例肝功能受损较重的患者,其余患者均口服利福平、多西环素、抗生素抗感染治疗,3例肝功能受损的患者予以保肝药物、抗生素对症治疗;此26例患者平均住院7天,院外药物治疗1-5个月后复查各项指标均恢复正常。结论1.AMOS-PCR能特异性的检出所有布鲁氏菌种,26例患者血培养阳性物AMOS-PCR与MLVA测序结果相符,MLVA测序进一步显示26例患者血培养阳性物为羊3型布鲁氏菌。MLVA方法在确定布鲁氏菌属种上具有足够的区分力,可作为布鲁氏菌分离株的流行病学溯源工具。2.26例羊型布鲁氏菌感染患者出现肝功能异常、肌酐降低、肌酸激酶升高等特点,部分患者并胸腔积液、腹腔积液或心包积液,积极抗感染的同时,需兼顾并发症的治疗。3.26例患者在出院后继续口服药物对症治疗1-5个月内肝功能、肾功能恢复正常的同时,胸腔积液、腹腔积液以及心包积液消失4.所有患者的血培养菌株基因型均为42型布鲁氏菌,基因型与临床特征之间无明显的相关性。