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目的:探究肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)中生物钟基因PER1与脂质代谢的关系、综合评价西黄丸抗肝癌效应及生物钟基因PER1对西黄丸抗肝癌效应的影响。方法:1.生物钟基因PER1与HCC脂质代谢相关研究:通过RT-PCR及Western Blot实验检测课题组五种HCC细胞株(JHH-7、HuH-7、HepG2、SMMC-7721、HLF)中生物钟基因 PER1表达量。使用搭载 PER1 沉默慢病毒(shPER1#1#2#3)及搭载空载质粒慢病毒(PER1-NC)转染PER1表达量最高HCC细胞株,体外构建生物钟基因PER1沉默稳转株。验证转染效率后,提取实验组细胞mRNA,检测AMPK、SREBP-1、ACC1、SCD1的表达情况。油红O染色检测细胞内脂滴含量。CCK-8检测PER 1沉默后HCC细胞的增殖情况。为进一步探讨PER 1调控HCC脂质代谢的分子机制,设置空载质粒组(NC组)、PER1沉默组(shPER1组)、shPER 1+AMPK抑制剂组(Compound C 组),使用 Western Blot 检测 AMPK、p-AMPK、SREBP-1及其下游脂代谢关键酶类的蛋白表达水平。2.西黄丸抗肝癌效应研究:采用 50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、4 0 0μg/mL西黄丸萃取液作用于HCC细胞,CCK-8实验检测24h、48h、72h后450nm处OD值,并绘制细胞增殖曲线;集落实验检测西黄丸对 HCC细胞的集落生成率的影响;划痕实验检测西黄丸对HCC细胞的迁移率的影响;Transwell迁移及侵袭实验检测西黄丸对 HCC 细胞侵袭转移能力的影响;流式细胞仪和Annexin-V/PI法检测西黄丸对HCC细胞凋亡率的影响。3.生物钟PER1影响西黄丸抗肝癌效应研究:设置对照组、空载质粒组(NC组)、PER1沉默组(shPER1组),400 μ g/mL西黄丸萃取液作用于NC组及shPER1组。CCK-8、集落实验检测三组实验细胞增殖能力;划痕、Transwell实验检测三组实验细胞迁移及侵袭转移能力。4.西黄丸调节生物钟基因 PER1 研究:选取生物钟基因 PER1表达量最高及最低的两株HCC细胞,分别使用5 0μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL 西黄丸萃取液进行干预。提取实验组细胞mRNA及蛋白后,RT-PCR及Western Blot检测生物钟基因PER1的表达量。结果:1.RT-PCR及Western Blot实验结果表明,HCC细胞株JHH-7的PER1表达量最高,HLF的PER1表达量最低(P<0.0001);选取JHH-7体外构建PER 1沉默稳转株并验证其转染效率。与NC组相比,shPER1#3 能显著降低 PER1 的 mRNA 及蛋白水平(P<0.0001)。利用构建成功的PER1沉默稳转株进行后续实验,结果显示,沉默PER1后,AMPK的mRNA表达水平下调,SREBP-1、ACC1、SCD1的mRNA表达水平上调;油红O染色结果显示,PER1沉默后HCC细胞中脂滴含量增多(P<0.001);CCK-8实验结果显示,PER1沉默后,HCC细胞的增殖能力提高(P<0.05);进一步检测蛋白层面的表达情况,结果显示,沉默PER 1后,AMPK蛋白水平无明显变化,p-AMPK蛋白下调,SREBP-1及其下游脂代谢关键蛋白ACC1、SCD1的表达上调。加入Compound C抑制AMPK磷酸化后,p-AMPK、SREBP-1、ACC1、SCD1的蛋白表达被逆转。2.CCK-8 实验结果表明,100μg/mL、20 0μg/mL、400μg/mL 西黄丸萃取液均能直接抑制 HCC细胞的增殖,且抑制效率随着西黄丸萃取液浓度的升高而逐步增强,呈时间和浓度依赖性(P<0.01);集落实验表明,100μg/mL西黄丸萃取液即能抑制HCC细胞集落生成率(P<0.05);划痕实验表明,1 00μg/mL西黄丸萃取液即能显著抑制 HCC 细胞迁移能力(P<0.01);Transwell 实验结果表明,50μg/mL西黄丸萃取液即能抑制肝癌细胞迁移及侵袭转移能力(P<0.01);Annexin V-FITC/PI凋亡检测结果表明,与对照组相比,100μg/mL西黄丸萃取液即能诱导HCC细胞早期及晚期凋亡(P<0.05)。3.沉默生物钟基因PER 1后,西黄丸抑制HCC细胞增殖、集落生成、迁移及侵袭转移的能力均下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.RT-PCR实验结果表明,在生物钟基因PER1高表达的JHH-7细胞及低表达的HLF细胞中,200 μg/mL及4 0 0μg/mL西黄丸萃取液均能够上调PER 1 mRNA的表达。Western Blot实验结果表明,在 HLF 细胞中,PER1 蛋白的表达水平与 mRNA 趋势相同,200 μg/mL西黄丸萃取液即能上调PER1蛋白的表达水平(P<0.01)。在JHH-7细胞中,400μg/mL西黄丸萃取液才能上调PER1蛋白表达水平(P<0.0 1)。结论:生物钟基因PER1通过AMPK/SREBP-1信号通路抑制脂肪从头合成,调节HCC的脂质代谢并通过抑制HCC细胞恶性增殖,与西黄丸联合发挥抗肝癌作用。提示生物钟基因PER1可能成为抗肝癌治疗新的药理学靶点。