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本论文分别采用荧光发射光谱法、荧光相图法、荧光探针、荧光猝灭法,以及非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法、十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳法和体积排阻色谱法对尿素和盐酸胍诱导的淀粉液化芽孢杆菌α—淀粉酶的去折叠过程和重折叠过程进行了研究。本论文的研究结果将为人们进一步了解淀粉液化芽孢杆菌α—淀粉酶分子的折叠过程提供有益的帮助。
荧光发射光谱和荧光相图法的结果表明:无论采用盐酸胍还是尿素作为诱导剂,芽孢杆菌α—淀粉酶的去折叠和重折叠过程都存在一个稳定的折叠中间态,它们的去折叠和重折叠过程均符合“三态模型”。以盐酸胍为诱导剂时,折叠中间态均出现在诱导剂浓度约为1.0 mol/L;而以尿素为诱导剂时,折叠中间态均出现在诱导剂浓度约为4.0 mol/L。因此,尿素和盐酸胍诱导的芽孢杆菌α—淀粉酶的去折叠和重折叠过程可以看作是一个可逆过程。
ANS外源荧光探针结果表明:盐酸胍诱导的芽孢杆菌α—淀粉酶分子去折叠过程中存在着能够与探针分子1—苯胺基-8—萘磺酸(ANS)结合的稳定的疏水区域;而随着芽孢杆菌α—淀粉酶分子在盐酸胍溶液中变性程度的加深,这一疏水区域逐步被瓦解。
丙烯酰胺和碘化钾猝灭结果表明:在盐酸胍溶液中,随着芽孢杆菌α—淀粉酶分子变性程度的进一步加深,其分子内能够被丙烯酰胺接近的色氨酸残基逐渐增多,直至全部被猝灭。但位于芽孢杆菌α—淀粉酶分子表面的能够被碘化钾猝灭的色氨酸残基,在中间态芽孢杆菌α—淀粉酶分子中数目达到最大的8个,而随着其分子变性程度的进一步加深,反而减少至5个。
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳和体积排阻色谱结果表明:无论以尿素或盐酸胍作为变性剂,在芽孢杆菌α—淀粉酶的去折叠和重折叠过程中,α—淀粉酶分子都始终以单分子形式存在,没有出现任何形式的聚集体或集聚体沉淀。
综合以上实验结果,我们对淀粉液化芽孢杆菌α—淀粉酶的去折叠以及重折叠过程进行了描述:盐酸胍诱导的淀粉液化芽孢杆菌α—淀粉酶的去折叠以及重折叠过程都存在在一个部分折叠中间态,出现在诱导剂浓度约1.0 mol/L时,均符合“三态模型”,在盐酸胍诱导的淀粉液化芽孢杆菌α—淀粉酶的去折叠以及重折叠过程过程中,芽孢杆菌α—淀粉酶分子始终以单分子形式存在,没有出现任何形式的聚集体或聚集体沉淀。尿素诱导的淀粉液化芽孢杆菌α—淀粉酶的去折叠以及重折叠过程都存在在一个部分折叠中间态,出现在诱导剂浓度约4.0 mol/L时,均符合“三态模型”。在尿素诱导的淀粉液化芽孢杆菌α—淀粉酶的去折叠以及重折叠过程过程中,芽孢杆菌α—淀粉酶分子始终以单分子形式存在,没有出现任何形式的聚集体或聚集体沉淀。