【摘 要】
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目的:验证mir-301b-5p通过TXNIP/NLRP3轴调控wnt/β-catenin通路在大鼠先天性肛门直肠中的研究。研究方法:1.60只孕鼠随机分为正常组和ARM组,ARM组:1%125ml/kg ETU;正常组:等量生理盐水。GD14、GD15和GD16无菌条件下剖宫取胎,收集胎鼠肛门直肠部位组织。2.Western blot、免疫组化检测TXNIP、NLRP3炎性小体在正常组和ARM组
【基金项目】
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国家自然科学基金（No.82070531）；
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目的:验证mir-301b-5p通过TXNIP/NLRP3轴调控wnt/β-catenin通路在大鼠先天性肛门直肠中的研究。研究方法:1.60只孕鼠随机分为正常组和ARM组,ARM组:1%125ml/kg ETU;正常组:等量生理盐水。GD14、GD15和GD16无菌条件下剖宫取胎,收集胎鼠肛门直肠部位组织。2.Western blot、免疫组化检测TXNIP、NLRP3炎性小体在正常组和ARM组直肠末端的差异性表达。q RT-PCR和FISH检测对照组和ARM组mir-301b-5p的时空表达差异。3.在IEC-6中转染si-NC/TXNIP,Western Blot检测NLRP3炎性小体的表达变化,ELISA检测细胞上清液中IL-1β和IL-18的含量。4.在IEC-6中转染mir-NC/mimic,q RT-PCR和Western Blot分别检测TXNIP m RNA和蛋白的表达,进一步通过双荧光素酶检测mir-301b-5p与TXNIP之间的结合位点。5.在IEC-6中转染mir-NC/mimic,Western Blot检测NLRP3炎性小体的蛋白表达情况,ELISA检测细胞上清液中分泌的IL-1β和IL-18,cck-8检测过表达mir-301b-5p对细胞活力的影响。6.Western Blot检测过β-catenin在mir-301b-5p调控TXNIP/NLRP3中蛋白表达情况。7.所有的实验数据用均值±标准差表示,每组实验数据至少做三次生物学重复。使用SPSS 19.0和Prism 8.0软件进行统计学分析,p＜0.05表示有统计学差异。结果:与正常组胎鼠末端直肠相比,TXNIP和NLRP3炎性小体在ARM组的GD15和GD16蛋白表达明显上调。2.在GD15和GD16,对比正常组,ARM胎鼠的直肠末端的mir-301b-5p表达下调。3.与NC组相比,在IEC-6中敲低TXNIP抑制NLRP3活性,cleaved-caspase-1的蛋白表达量降低及IL-1β和IL-18含量减少。4.与NC组相比,过表达mir-301b-5p后TXNIP m RNA和蛋白表达量降低,进一步的双荧光素酶试验核实TXNIP是mir-301b-5p的直接靶标。5.与NC组相比,在IEC-6中过表达mir-301b-5p使NLRP3活性受抑制,NLRP3/cleaved-caspase-1的蛋白表达降低,细胞上清液中分泌的IL-1β和IL-18也减少,且过表达mir-301b-5p会减少细胞死亡,增强细胞活力。6.与NC组相比,过表达mir-301b-5p引起β-catenin蛋白表达量降低。结论:研究结果表明,mir-301b-5p通过TXNIP/NLRP3轴调控wnt/β-catenin通路参与ARM的病理过程。
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