【摘 要】
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在天然界中,羟基位于β-位的脂肪酸（Fatty acids,FAs）称为β-羟基脂肪酸（β-OH Fatty acid,β-OH FAs）,它们具有优秀的生物活性,是良好的化学合成前体,在许多领域应用都颇为广泛。但β-OH FAs尤其是手性β-OH FAs在化学合成上存在诸多限制:底物不易获取、底物不可再生、反应通常需要过渡金属和复杂的催化配体或昂贵的化学计量手性助剂的参与等。本课题研究对象P45
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在天然界中,羟基位于β-位的脂肪酸（Fatty acids,FAs）称为β-羟基脂肪酸（β-OH Fatty acid,β-OH FAs）,它们具有优秀的生物活性,是良好的化学合成前体,在许多领域应用都颇为广泛。但β-OH FAs尤其是手性β-OH FAs在化学合成上存在诸多限制:底物不易获取、底物不可再生、反应通常需要过渡金属和复杂的催化配体或昂贵的化学计量手性助剂的参与等。本课题研究对象P450BSβ是P450酶家族的一种羟基化酶,虽然能够一步氧化自然界中广泛存在的、绿色可再生的FAs,但反应由于较差的区域选择性生成1-烯烃、α-羟基脂肪酸（α-OH Fattyacid,α-OH FAs）和β-OHFAs三种产物。本研究通过对P450BSβ反应机理和蛋白结构的研究,对P450BSβ进行定向进化获得了一个工程化的酶突变体P450Bsβ-L78A/Q85A/V170I/G290I,实现以肉豆蔻酸（C14:0）为底物的区域选择性和立体异构选择性专一的催化脂肪酸β-位C-H羟基化反应,表现为β-羟基肉豆蔻酸产物:α-羟基肉豆蔻酸产物＞20:1以及β-羟基肉豆蔻酸产物的ee＞99%。该生物催化剂以廉价的过氧化氢作为氧化剂,在常温常压水相等温和的反应条件下,将易得、可再生的肉豆蔻酸专一的转化为手性的（R）-β-羟基肉豆蔻酸,而且具有良好的反应活性——转换数（Turnover number）和转换效率（Turnover frequency）分别达到1540和45.6 min-1。进一步的分子对接研究为该反应专一的区域选择性和立体异构选择性提供了理论基础:相较于野生型P450BSβ与底物的结合构像,在突变体P450BSβ-L78A/Q85A/V170I/G290I与底物的结合构像中,底物的Cα-亚甲基离酶活性中心更远而Cβ-亚甲基离酶活性中心更近,这解释了专一的区域选择性。此外,在突变体P450BSβ-L78A/Q85A/V170I/G290I与底物结合构象中,底物的Cβ-亚甲基的pro-R-H 比pro-S-H更接近酶活性中心,从而解释了 P450BSβ-L78A/Q85A/V170I/G290I突变体酶催化产物为专一的R构型产物。本课题的研究内容以实际应用为目标,在蛋白质工程,生物合成、结构生物学等多个领域进行探索,利用生物酶法代替传统的有机合成方法合成（R）-β-羟基化脂肪酸,推动绿色、环保的生物催化在合成β-OH FAs的应用。
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