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基因转运载体的选择,是保障系统能够高效、安全地携带基因作用于靶向部位、有效发挥治疗作用的关键。层状复合氢氧化物(Layered Double Hydroxides,LDHs),具有水滑石层状晶体结构,层片由两种或两种以上的金属元素构成,层板带正电荷,层间存在可交换的阴离子。DNA可插入层间与LDH层板建立静电、氢键作用以及发生空间位阻效应,使LDHs/DNA杂化复合物具有特殊的细胞传输性能、良好的生物相容性、有利于降解以及控制释放等优势,因此LDH作为一种新型的基因转运载体受到广泛的关注和开发。 本文将DNA作为客体分子,以顺磁性的铁系离子构成层板的磁性层状复合氢氧化物(Magnetic Layered Double Hydroxides,MLDH)为载体,研究磁性层状复合氢氧化物-基因运载系统(MLDH/DNA)的制备、细胞内化及其体内磁靶向转运效果,为磁性层状复合氢氧化物应用于基因载体提供实验依据及理论基础。本文的主要研究内容包括以下三个部分: 1.磁性层状复合氢氧化物基因运载系统构筑表征 用共沉淀法合成的MLDH作为载体,以表达绿色荧光蛋白的pEGFP-N1或鲑鱼精DNA为客体,通过共沉淀和离子交换反应方法,制备磁性MLDH/DNA基因转运复合物;利用粉末X射线衍射、红外光谱分析及热重分析方法进行了物相表征,通过凝胶阻滞实验评价了不同条件下MLDH对DNA的结合与保护效果。XRD分析表明,MLDH具有六方晶系特征,DNA会干扰MLDH的层状堆积秩序,但LDH层板结构在复合物中得到保留。Fe-O-Fe间距发生微小调整,MLDH/DNA基因转运复合物的(006)晶面衍射强度增大,并在14~17°区间出现新的晶相衍射。IR光谱证明,MLDH/DNA复合结构中MLDH与客体DNA共存、并发生了有效复合。MLDH/DNA基因转运复合物在67.7~650.0℃温度区间,表现有三个失重段,分别与湿固相的含水量、LDH层板羟基的脱水缩合和层间有机残基复合物的深度分解相关。透射电镜观察显示,MLDH的层状特征比普通LDH强,但六边形的不规则程度高,与DNA结合的亲和力强,可形成大小不一、形状不同的转运复合物。凝胶阻滞实验表明,MLDH能够有效结合分子量小于1Kb的DNA。在不同pH条件下,尤其在酸性条件下,磁性层状复合氢氧化物能够有效保护层间DNA分子,低于生理条件的核苷酸酶和血清实验证明,MLDH能够保护DNA。MTT细胞毒性实验结果显示MLDH对A549、SGC-7901和SKOV3三种不同株系的细胞增殖活性有一定影响,并对细胞的增殖抑制作用存在一定的剂量、时间依赖性特征,细胞活性随着MLDH浓度的增加而降低。 2.磁性层状复合氢氧化物-基因运载系统的细胞传输过程研究 为了解MLDH/DNA基因转运复合物的细胞内化过程,MLDH/DNA复合物干预SGC-7901细胞,通过体外细胞吞噬铁染色实验方法,采用普通的倒置显微镜宏观观察了铁染色阳性细胞;透射电镜进一步跟踪了MLDH/DNA复合物在亚细胞器中的分布特点;用YOYO-1核酸染料标记MLDH/DNA复合物,激光扫描共聚焦显微镜技术研究了细胞的吞噬过程。结果表明:MLDH/DNA基因转运复合物能够随时间的推移,被细胞吞噬进入细胞质,最终将DNA成功转运至细胞核。 3.磁性层状复合氢氧化物-基因运载系统的体内磁靶向转运效果 用近红外染料标记基因运载系统、制成MLDH-DNA/Nucleic Acid Labeling复合物,以昆明小鼠为实验动物,通过活体成像技术考察了MLDH/DNA基因转运复合物在小鼠体内的实时分布与磁靶向转运情况,结果表明MLDH/DNA基因转运复合物能够携带基因通过血液循环系统进入不同组织器官,表现出明显的磁靶向特异性。实验通过磁场诱导,MLDH运载DNA能够定向转运至特定组织器官,为实现靶向转染或基因治疗提供了依据。