靶向CD248分子干预小鼠肝纤维化形成的机制研究

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背景肝纤维化(Hepatic fibrosis)表现为肝星状细胞(HSC)活化增殖和细胞外基质蛋白(ECM)过多沉积,为多种慢性肝脏疾病的最终结局。探究肝纤维化无创生物标志物以及有效干预策略意义重大。CD248在纤维化中能检测到表达,敲除CD248基因可抑制纤维化进程,显示CD248与纤维化等疾病发生发展相关,但CD248在纤维化中的具体作用机制仍不明确。目的1.通过前期自制CD248单克隆抗体,探索CD248分子作为肝纤维化生物标志物的可能性;2.探索抗体中和干扰CD248分子是否影响纤维化发展,进而明确CD248是否具有作为纤维化治疗靶标的潜能。方法1.检测CD248表达:收集正常体检者和肝硬化患者血清,以及肝硬化患者病理标本;构建小鼠肝纤维化模型;使用研究团队前期自制CD248单抗进行检测,探究血清及肝脏中CD248的表达情况。2.靶向CD248分子干预小鼠肝纤维化:将小鼠随机分为三组,分别予以抗体组与模型组腹腔注射25%四氯化碳橄榄油溶液以诱导肝纤维化,予以正常组同等剂量橄榄油;于注射第2周起,予以抗体组尾静脉注射CD248单克隆抗体,每周2次,共注射6次。于四氯化碳注射第6周结束后处死小鼠,收集血清与肝脏。检测小鼠血清中AST、ALT水平,HE和天狼星红染色检测肝脏纤维化程度,Western Blot、免疫组化和qRT-PCR检测肝脏中α-SMA、Collagen Ⅰ的蛋白与mRNA水平。3.CD248参与肝纤维化机制初探:Western Blot、免疫组化和qRT-PCR检测肝脏中VEGF和HIF-1α的蛋白与mRNA水平。结果1.免疫印迹结果表明,与正常体检者相比,肝硬化患者血清中CD248水平升高,且存在个体差异性。免疫组化结果表明,CD248在肝硬化组织中高表达。小鼠肝纤维化模型中检测到CD248高表达。2.肝功检测和HE及天狼星红染色结果表明,与正常组相比,模型组小鼠AST、ALT明显升高,有明显纤维化(P<0.05);与模型组相比,抗体组小鼠AST、ALT降低,纤维化程度减轻(P<0.05)。Western Blot、免疫组化和qRT-PCR结果表明,与模型组相比,抗体组小鼠肝脏中α-SMA、Collagen I表达水平降低(P<0.05)。抗体组小鼠予以抗体干预后,CD248表达减少。3.Western Blot、免疫组化和qRT-PCR结果表明,与模型组相比,抗体组小鼠肝脏中VEGF和HIF-1α表达水平降低(P<0.05)。结论1.采用自制抗体可以检测到CD248在肝硬化患者血清升高,亦可以检测到小鼠肝纤维化模型中的升高。显示CD248分子具有成为纤维化生物标志物的潜能。2.CD248单抗的干预减轻小鼠肝纤维化形成,可能与影响HSC活化增殖与减轻血管增生有关,CD248分子具有成为治疗肝纤维化新靶点的潜能。
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