胰岛素样生长因子2（Insulin-like growth factor 2,IGF2）是胰岛素/IGF系统的一个重要组成部分,能调节细胞生长、增殖及代谢。血液中的IGF2主要来源于肝脏。IGF2是哺乳动物中几百个印记基因之一,其转录活性不仅会受到启动子区甲基化状态的影响,还受到印记控制区（imprinting control region,ICR）甲基化状态的调控。甜菜碱是甘氨酸的三甲基衍生物,它在机体内的来源有两个。一是通过饮食摄入,二是在肝脏与肾脏中通过胆碱内源性合成。在肝脏中甜菜碱的主要作用是作为甲基供体参与代谢。过去人们发现饲料添加甜菜碱能促进动物生长,可能和提高的血液GH/IGF1水平有关。甜菜碱对生长因子IGF2表达的影响少有报道。此外,过去对甜菜碱的研究多集中在直接添加的促生长作用,或通过妊娠期日粮添加对新生儿代谢的作用,而缺乏母体甜菜碱对F1子代动物出生后的生长发育影响的相关报道,对F2代动物的生长发育的研究更是罕有报道。本研究的目的是阐述母鼠日粮添加甜菜碱对F1/F2子代大鼠肝脏IGF2表达的继代影响,并揭示其机制。1母鼠日粮添加甜菜碱对F1代断奶仔鼠肝脏IGF2表达的影响及机制40只平均体重约400g的3月龄Sprague-Dawley雌鼠（F0）交配后饲喂不同日粮并分组。对照组母鼠饲喂基础日粮,甜菜碱组饲喂添加甜菜碱的日粮。甜菜碱（纯度98%,Sigma-Aldrich）以10g/kg的水平混匀在基础饲料中。所有大鼠均在受控的温度（22±0.5℃）、湿度（50±5%）和光照（12小时光照/12小时黑暗）的环境下饲养,动物可以自由进食和饮水。F1代仔鼠出生后,记录产仔数和出生重后,将每窝幼仔数调整为10只（5只雄性和5只雌性）。在第21天（D21）断奶,此后所有鼠的日粮都使用基础日粮。除断奶采样的仔鼠外,其余的F1仔鼠饲养至45日龄（D45）,然后从每组中挑选10只雄性仔鼠,并每笼单只饲养至63日龄（D63）。母鼠日粮添加甜菜碱显著增加了产仔数和窝重（P<0.05）,而F1代雄鼠出生重、断奶重和45日龄体重低于对照组（P<0.05）。甜菜碱组45日龄到63日龄期间的平均日增重显著高于对照组（P<0.05）,至63日龄体重在两组无显著差异。免疫组化染色发现,甜菜碱组F1断奶雄性仔鼠肝脏增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）阳性细胞数高于对照组（P<0.05）。肝组织中PCNA蛋白水平,以及周期蛋白1（cyclin D1,CCND1）和PCNA的mRNA水平在甜菜碱组显著高于对照组（P<0.05）,说明肝细胞的增殖增加。脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling,TUNEL）结果发现,甜菜碱组的TUNEL 阳性细胞数高于对照组（P<0.05）,说明肝细胞的凋亡也增强。细胞内信号通路检测发现,甜菜碱组ERK介导的增殖和AMPK介导的凋亡途径均被激活。断奶时,甜菜碱组大鼠肝脏IGF2免疫组化阳性染色、肝组织中IGF2蛋白水平和血清游离IGF2水平均高于对照组（P<0.05）。在转录水平,甜菜碱组肝脏4种IGF2变体mRNA水平均高于对照组（P<0.05）,且总IGF2与H19mRNA的比值高于对照组（P<0.05）。进一步研究发现,IGF2基因启动子区甲基化水平在甜菜碱组不变,但是4个IGF2/H19印记控制区CTCF位点中有3个位点在甜菜碱组显著升高（P<0.05）。另外,甜菜碱组的肝脏中甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶（betaine homocysteine methyltransferase,BHMT）和 DNA 甲基转移酶 1（DNA（cytosine-5）-methyltransferase 1,DNMT1）蛋白水平显著高于对照组（P<0.05）。以上结果推测,断奶时甜菜碱组F1雄鼠肝脏甲基化过程增强,改变了 ICR甲基化状态。ICR的高甲基化状态可能与IGF2转录升高有关。另一方面,母体甜菜碱组子代可能通过母乳或者采食的方式接触了额外的甜菜碱,激活了肝脏凋亡信号通路。2母鼠日粮添加甜菜碱对F1代成年子鼠肝脏IGF 2表达的影响及机制甜菜碱通过母体影响后代新生儿生长以及代谢的研究已有报道。但是对于后代成年期的研究尚未见报道。前面的研究结果发现,尽管母鼠日粮添加甜菜碱的F1子代雄鼠的出生体重和断奶体重较低,但在成年时表现出追赶性生长。为揭示这一现象,我们进一步研究了 D63时雄性仔鼠肝脏细胞增殖和凋亡状况,以及肝脏IGF2表达及其调控的相关机制。免疫组化染色发现,在甜菜碱组F1成年雄性仔鼠肝脏PCNA 阳性细胞核数高于对照（P<0.05）。和断奶时相似,肝组织中PCNA蛋白水平和PCNA的mRNA水平,在甜菜碱组显著高于对照组（P<0.05）,说明肝细胞增殖增加。但是,成年时甜菜碱组肝脏TUNEL 阳性细胞核数低于对照组（P<0.05）,相应的Caspase 3活性也降低,说明此时肝细胞的凋亡减弱。细胞内信号通路检测发现,甜菜碱组肝脏AKT/ERK介导的增殖被激活,而AMPK介导的凋亡途径减弱。成年时,肝脏IGF2免疫组化阳性染色、IGF2蛋白水平和血清游离IGF2水平均高于对照组（P<0.05）。和断奶时相似,成年时甜菜碱组肝脏4种IGF2变体mRNA水平均高于（P<0.05）对照组,总IGF2与H19mRNA的比值高于对照（P<0.05）。通过MeDIP检测发现,肝脏4个IGF2启动子区甲基化水平在甜菜碱组不变,然而在4个IGF2/H19印记控制区CTCF位点中有3个位点在甜菜碱组显著高于对照（P<0.05）。成年雄鼠肝脏中BHMT和DNMT1等相关蛋白水平均在两组中未有显著差异。从以上结果推测,肝脏IGF2转录水平上升可能与ICR高甲基化状态有关。从断奶到成年期间,两组饲喂的都是基础日粮,这暗示着成年时的ICR甲基化印记可能是从断奶时保留至成年。另一方面,在成年时甜菜碱组较高的血清IGF2可能与该时期生长快有关。3祖代母鼠日粮添加甜菜碱对F2代断奶仔鼠肝脏IGF 2表达的影响及机制前面我们研究了母体甜菜碱对F1代仔鼠生长及肝脏的IGF2表达的影响,但是对于F2代仔鼠有无影响还未见相关报道。为了认识祖代母鼠甜菜碱对大鼠生长及肝脏IGF2表达的继代影响,我们观察了 F2代雄性仔鼠在断奶时的生长状况,并进一步研究了 F2代断奶肝脏细胞增殖和凋亡状况,以及IGF2表达调控中相关的机制。本实验使用40只交配后的雌性F1大鼠繁育F2子代大鼠,按照雌鼠不同来源分成F2对照组和F2甜菜碱组,每组20只。F2代仔鼠出生后,记录产仔数和出生重后将每窝幼仔数调整为10只（5只雄性和5只雌性）。在第21天将F2雄性后代断奶并采样。祖代母鼠日粮添加甜菜碱没有影响F2代的产仔数、窝重和F2雄鼠出生重,但是断奶重高于对照组（P<0.05）。F2断奶时,甜菜碱组肝脏PCNA阳性细胞数高于对照组（P<0.05）。肝脏PCNA蛋白和mRNA水平在甜菜碱组高于对照组（P<0.05）,说明肝细胞增殖增加。另外,甜菜碱组肝脏TUNEL 阳细胞数低于对照组（P<0.05）,说明肝细胞的凋亡减弱。细胞内信号通路检测发现,在甜菜碱组AKT/ERK介导的增殖被激活,而AMPK介导的凋亡途径减弱。F2断奶时,甜菜碱组肝脏IGF2免疫组化阳性染色和肝脏IGF2蛋白水平,以及血清游离IGF2水平均高于对照组（P<0.05）。在转录水平,甜菜碱组肝脏4种IGF2转录变体mRNA、总IGF2和H19 mRNA水平均高于对照（P<0.05）,但总IGF2与H19mRNA比值不变。MeDIP结果显示,F2代断奶时4个IGF2/H19印记控制区CTCF位点甲基化状态在两组没有差异,但4个不同IGF2启动子区甲基化水平均在甜菜碱组降低（P<0.05）。与甲基化过程相关的蛋白只有DNA甲基转移酶3A在甜菜碱组表达降低（P<0.05）。据以上结果推测,祖代母鼠日粮添加甜菜碱可能影响F2代断奶仔鼠肝脏IGF2启动子甲基化而非印记控制区甲基化,提高了 IGF2转录水平,进而影响肝脏IGF2蛋白表达。较高的IGF2血清浓度与断奶时体重增加有关。4甜菜碱对HepG2细胞IGF2基因表达的继代影响及机制前面的在体实验发现,母鼠日粮添加甜菜碱可以促进F1子代断奶和成年时肝脏的IGF2基因表达,同时还改变了 IGF2/H19印记控制区的甲基化修饰。我们使用甜菜碱处理HepG2细胞为模型,以研究甜菜碱添加能否直接影响肝细胞的IGF2基因表达,是否同样改变印记控制区甲基化状态,以及能否通过有丝分裂传递到子代细胞。HepG2细胞使用完全培养基（含10%FBS、抗生素的高糖DMEM培养基）培养。六孔板每孔种下5×105个细胞,48h后使用甜菜碱处理细胞,处理24h后收样（P0细胞）。P0细胞消化传代种板48 h后,无添加甜菜碱继续培养24 h后收获（P1细胞）。前期在Cell Counting Kit-8（CCK8）实验中,使用不同浓度甜菜碱处理HepG2细胞后,发现20 mM浓度处理48 h后P0代HepG2细胞的CCK8活力显著高于对照（P<0.05）。根据CCK8的结果,选择20 mM甜菜碱浓度进行后续实验。P1代HepG2细胞,在种下48 h和72 h后CCK8活力均显著高于对照（P<0.05）。流式细胞仪检测细胞周期结果发现,甜菜碱组P0和P1细胞的增殖均高于对照（P<0.05）。同样,甜菜碱组P0和P1细胞的PCNA蛋白水平均高于对照组（P<0.05）。在甜菜碱组,P0细胞的Caspase 3酶活高于对照组（P<0.05）,但是P1细胞的Caspase 3酶活低于对照组（P<0.05）。相应的甜菜碱组P0细胞的凋亡水平高于对照组（P<0.05）,但P1细胞的低于对照组（P<0.05）。细胞内信号通路检测发现,在P0代细胞,甜菜碱组AKT/ERK介导的增殖和AMPK介导的凋亡途径均被激活。在P1代细胞,甜菜碱组AKT/ERK介导的增殖被激活,但是AMPK介导的凋亡途径减弱。与在体F1代大鼠断奶和成年实验相似,甜菜碱组P0和P1细胞IGF2蛋白水平高于对照（P<0.05）。甜菜碱组IGF2与H19 mRNA 比值升高（P<0.05）,同时4种IGF2转录变体mRNA水平也在甜菜碱处理组P0和P1细胞中增加（P<0.05）。MeDIP结果发现,在甜菜碱组P0和P1细胞中,4个IGF2启动子区甲基化水平不变,但是IGF2/H19印记控制区的CTCF结合位点甲基化水平升高（P<0.05）。甲硫氨酸循环相关蛋白检测,发现甜菜碱使P0细胞甘氨酸N-甲基转移酶（glycine N-methyltransferase,GNMT）升高（P<0.05）。两组的P1细胞中,甲硫氨酸循环相关蛋白和DNMT1都没有改变。以上结果表明,甜菜碱处理可以增强HepG2细胞的IGF2表达,同时HepG2细胞的印记控制区CTCF位点高甲基化。甜菜碱处理影响到无甜菜碱处理的P1代细胞的IGF2表达,伴随着甲基化印记传递到P1细胞。综上所述,母鼠日粮添加甜菜碱提高了 F1子代断奶和成年时大鼠肝脏IGF2表达伴随着IGF2/H19印记控制区高甲基化,提高了 F2子代断奶时大鼠肝脏IGF2表达伴随着IGF2启动子低甲基化。在体外,甜菜碱提高了 HepG2细胞IGF2的表达,同时IGF2/H19印记控制区高甲基化状态可传递到子代细胞。