研究背景和目的:成骨不全（Osteogenesis imperfecta,OI）是一种罕见的遗传性骨骼疾病,临床上主要表现为反复骨折和骨骼畸形,还有一些骨骼外表现,如蓝巩膜,牙齿发育不全（Dentinogenesis Imperfecta,DI）等。大部分OI是由I型胶原蛋白编码基因（COL1A1和COL1A2）的常染色体显性突变导致的,Ⅰ型胶原编码基因突变引起Ⅰ型胶原蛋白数量或结构的改变。过去十几年中,很多非Ⅰ型胶原编码基因陆续被人们发现,它们虽然不直接编码Ⅰ型胶原蛋白,但参与Ⅰ型胶原蛋白的合成、加工、分泌和翻译后修饰,以及调节骨矿化和成骨细胞分化,这些基因导致的OI大部分表现为常染色隐形遗传（Autosomal Recessive Inheritance,AR）,少数表现为常染色体显性遗传（Autosomal Dominant Inheritance,AD）和X染色体连锁遗传。医生可以根据临床表现、反骨骨折的病史以及影像学特征给予患者临床诊断,但基因检测才是诊断OI的金标准。由于新基因的不断发现使OI的分型变得十分复杂,近几年基因分型得到了专家学者的广泛认可,即经典的Sillience分型仅用于Ⅰ型胶原编码基因突变导致的OI,非Ⅰ型胶原编码基因导致的OI随着新基因的发现给与它们相应新的分型编号。OI致病基因的多样性和临床表型的异质性也使其基因型和表型之间的关系变得复杂,其基因型-表型相关性尚未被阐述清楚。目前,临床上对于OI的治疗以双磷酸盐药物治疗、手术修复骨折和矫正畸形为主,治疗的目的主要是减少骨折和提高患者的活动能力,尚未找到一个能够从根本上治愈OI的方法。OI治疗方法的研究依赖多种动物模型,近些年专家学者利用经典的OI小鼠模型探索出一些治疗OI的新药物和新方法,其中基因治疗和干细胞治疗有望能够治愈OI。基于以上问题,本研究招募了 276名住院OI患者,最终116名患者通过基因检测确诊为OI,根据致病基因的不同类型、功能和遗传方式分析基因型和表型之间的关系,并评估双磷酸盐对不同基因型OI患者的治疗效果。本研究还对OI的经典模型小鼠进行了表型鉴定,为下一步研究OI治疗的新方法提供重要基础。第一部分成骨不全基因型-表型分析研究方法:1.研究对象研究对象来自2010-2020年在山东省立医院住院治疗的276名OI患者。按照严格的纳入和排除标准,最终116名患者通过基因检测确诊为OI被纳入本研究,并进行了长达平均6年的随访。2.临床数据收集通过查阅病例和随访获得患者的基本信息,包括年龄、身高、体重等;临床表现,包括首次骨折年龄、骨折次数、蓝巩膜、牙齿发育不良（DI）、独立行走能力、畸形情况等;治疗信息,包括治疗方法,治疗效果等。3.基因检测通过全外显子测序技术（Whole-Exome Sequencing,WES）对OI患者进行基因检测。4.统计分析经正态性检验后,本研究所有连续变量均符合偏态分布,采用非参数检验进行统计分析。连续变量均用中位数和四分位数间距表示,分类变量用计数表示。比较连续变量的两组差异用Mann-Whitney检验,三组以上的差异用Kruskal-Wallis检验和成对多重比较检验。用Fisher精确检验分析分类变量之间的差异。P＜0.05代表差异具有统计学意义。研究结果:1.临床表型分析所有患者普遍身材矮小,平均身高Z分数为-2.18（-4.15,-0.78）;患者首次骨折的平均年龄为0.96岁,在首次骨折发生的2年后获得临床诊断,10年后才能获得基因诊断。患者最常见的临床表现是蓝巩膜（86.2%）,其次是长骨畸形（81.0%）。2.基因型分析本研究共检测出6种致病基因（COL1A1、COL1A2、IFITM5、SERPINF1、FKBP10和WNT1）的116个突变,包括96个I型胶原基因突变和20个非I型胶原基因突变。在96个I型胶原基因突变中,有61个螺旋突变和21个单倍体剂量不足突变。3.基因型-表型分析3.1与发生COL1A1基因突变的患者相比,发生COL1A2基因突变的患者身高更矮、首次骨折的年龄相对较小。3.2螺旋突变比单倍体剂量不足突变导致患者的临床表型更严重,包括身高更矮、首次骨折年龄更小、DI和长骨畸形的发生率更高。3.3螺旋突变、单倍体剂量不足突变和非Ⅰ型胶原基因突变三者比较,螺旋突变导致的患者身高最矮,且最容易发生DI;单倍体剂量不足突变导致的患者首次骨折发生最晚;非Ⅰ型胶原基因突变导致的患者骨折频率最高,但最不容易出现蓝巩膜。3.4非Ⅰ型胶原基因突变的患者之间存在相对表型差异。3.5与AD相比,AR患者更容易发生骨折,独立行走能力更差,但更不容易出现蓝巩膜和DI。3.6帕米磷酸二钠能够显著降低OI患者的骨折频率,并且尚未发现其治疗效果与OI患者的基因型有关。研究结论:1.本研究进一步阐述了中国住院OI患者的基因型和表型之间的相关性,可为OI的分型和诊断提供精准指导。2.帕米磷酸二钠能够显著降低OI患者的骨折频率,尚未发现帕米磷酸二钠的治疗效果与患者的基因型有关,可为指导OI的治疗和预测OI患者的预后提供科学依据。第二部分成骨不全模型小鼠表型鉴定研究方法:1.成骨不全模型小鼠（oim小鼠）由杂合子雌雄小鼠交配获得,杂合子小鼠B6C3Fe a/a-Colla2oim购买自美国Jackson实验室,该小鼠在COL1A2基因上存在一个自发的单个核苷酸缺失突变。应用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）和Sanger测序鉴定小鼠的基因型。2.在小鼠4-8周龄时,对野生型（Wild Type,WT）小鼠和oim小鼠进行体重监测。3.在小鼠8周龄时,对WT和oim小鼠进行全身X线片拍摄。4.分别取8周龄WT和oim小鼠的股骨、胫骨,采用荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qPCR）检测胫骨中 COL1A2 的 mRNA 水平;采用 Western blot 检测胫骨中COL1A2的蛋白水平。5.采用苏木素-伊红（Hematoxylin-Eosinstaining,HE）染色检测小鼠股骨远端骨骼生长情况;采用masson染色检测小鼠股骨中I型胶原蛋白分布情况;采用goldner染色检测小鼠股骨矿化情况。6.采用微计算机断层扫描技术（Micro Computed Tomography,Micro-CT）检测小鼠股骨中骨小梁和骨皮质等微观结构。7.采用三点力弯曲试验检测小鼠股骨生物力学性能。研究结果:1.PCR和Sanger测序结果显示,WT小鼠COL1A2基因上没有单个核苷酸的缺失突变,oim小鼠两个等位基因上均发生单个核苷酸的缺失突变。2.与WT小鼠相比,oim小鼠体型较小,体重较轻。3.与WT小鼠相比,X线片显示oim小鼠全身骨骼骨密度明显降低。4.与WT小鼠相比,qPCR结果显示oim小鼠股骨中COL1A25.表达量显著减少;Western blot结果显示oim小鼠股骨中COL1A2蛋白表达明显下降。6.与WT小鼠相比,HE染色结果显示oim小鼠股骨远端骨小梁数量明显减少,骨皮质明显变薄;masson染色结果显示oim小鼠股骨中Ⅰ型胶原蛋白含量明显减少;goldner染色结果显示oim小鼠股骨中矿化骨减少,骨矿化明显异常。7.与WT小鼠相比,Micro-CT结果显示oim小鼠骨小梁变薄、数量减少、分离度增加,骨皮质变薄、横截面面积变小。8.与WT小鼠相比,三点力弯曲试验结果显示oim小鼠股骨的刚度以及最大载荷力均明显降低。研究结论:1.本研究中oim小鼠表现为明显的骨量减少、骨密度降低、骨力学性能下降,Ⅰ型胶原蛋白表达显著降低,符合成骨不全患者的临床特征。2.本研究中oim小鼠可以作为成骨不全的模型小鼠,用于开展治疗方法的研究。