淋病是常见的一种性传播疾病,发病率位居性传播疾病第二位,已成为全球主要的公共健康问题之一。目前还没有特效疫苗上市,使用抗菌药物治疗仍是淋病防治的主要手段,但随着对淋病的不规范诊疗,使得淋球菌抗性不断增强,多重耐药的现象也频频出现,严重影响了临床上淋病治疗的有效性。世界卫生组织（World Health Organization,WHO）在2017年将淋球菌列入了 12种需要优先研究和开发抗菌药物的细菌名单。及时掌握淋球菌耐药株的分子生物学特征和时空分布状况,从而采取有效的淋病防控策略是目前亟需解决的问题。从临床治疗层面来讲,需明确其耐药性基因变异并结合其耐药表型,选择敏感的抗菌药物进行治疗,从公共卫生层面来讲,需掌握其分子分型,了解耐药株传播、变异的时空分布模式,从而制定有效的疾病防控策略。近年来,迅速发展起来的纳米孔测序技术是一种新型单分子测序技术,具有长读长、便携、灵活和实时产出测序数据等诸多优势,目前已被应用于病原体鉴定与分型、基因组学研究和甲基化研究等多个领域。本研究第一部分以淋球菌为模式细菌,将纳米孔测序技术与多重PCR扩增技术相结合,开发出一种靶向性更强的病原体耐药及分子分型基因测序新方法,所需数据量更低、周转周期更短、操作流程更简便。在本部分的研究中,我们选取了 2株WHO推荐淋球菌标准株样本对R9.4.1和R10.3两种测序芯片的测序性能以及“Fast”和“Hac”两种碱基识别模式对测序准确度的影响进行了评估,从鉴定精度看,使用R10.3芯片测序并结合“Hac”碱基识别模式进行碱基识别可使测序准确度接近100%,从测序深度看,仅需30X就可满足正确进行分子分型和耐药性相关位点鉴定的需求,并且这一结论在14个分离株样本和9个临床样本的进一步准确度评估实验中也得到了验证。本部分所建立的纳米孔靶向测序方法适用于多种样本类型,对临床样本中细菌基因组载量仅要求1000拷贝。测序通量上,单张R10.3芯片在1次反应中可同时完成80个分离株样本或53个临床样本的测序,降低了单个样本的测序成本。此外,本研究部分构建了成熟的生物信息学分析管道,使非专业人员也可以通过执行很少的命令自动获得靶基因的测序序列,并提供了可修改的数据分析参数,帮助研究工作者实现个性化数据分析。总之,本研究部分所建立的方法,为临床治疗方案的制定提供了及时的证据,为研究耐药性菌株的进化规律、发现新的耐药性变异位点提供了新的技术手段,可作为一套成熟的体系外推到临床上其它重要病原体。淋球菌头孢曲松（Ceftriaxone,CRO）耐药FC428克隆已经在国际上广泛传播,我们在中国深圳地区分离到一株具有多重抗菌药物耐药性的FC428克隆株,为从全基因组水平了解其耐药性相关变异及物种进化关系,本研究第二部分基于纳米孔和Illumina测序平台,对其进行了全基因组测序,并根据其全基因组的序列信息构建了系统发育进化树。从测序结果来看,该菌株23S rRNA上携带的4拷贝C2611T单核苷酸变异可能是导致其中等水平阿奇霉素（Azithromycin,AZM）耐药性的主要原因。全基因组系统发育进化树证实FC428克隆株已经在中国地区得到了进一步传播,并且在传播过程中获得了更广泛和令人担忧的耐药性特征,为加强淋球菌耐药性监测提出了预警。本研究部分所建立的纳米孔全基因组测序方法,可以为病原体的耐药性研究提供更全面丰富的信息,可以帮助更精准地判断耐药菌株同源性的远近及其进化和传播轨迹,从而减缓或遏制病原体耐药株的蔓延。综上所述,本研究基于纳米孔测序技术平台以淋球菌为模式细菌构建了病原体靶向及全基因组测序方法,为病原体的分子生物学特征性研究提供了新的技术手段,同时,本研究中的实验数据也可以为采用相似测序策略的病原体相关研究提供参考。