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目的和意义:帕金森病伴发抑郁（Parkinson’s disease with depression,PDD）是帕金森病（Parkinson’s disease,PD）常见的非运动症状之一,可贯穿PD全病程,甚至加重PD患者的运动症状,严重影响其生活质量。柴胡加龙骨牡蛎汤（Chaihu and Longgu Muli Decoction,CLMD）出自张仲景《伤寒论·辨少阳病脉证并治》,多用于治疗神志异常类疾病,在PDD的临床治疗中取得了明显疗效。但目前关于CLMD治疗PDD的研究多为临床疗效观察,其发挥作用的具体分子生物机制尚不明确,基于体内外实验的理论研究相对缺乏。本研究应用网络药理学方法对CLMD治疗PDD的潜在靶点和可能机制进行了预测,通过建立PDD大鼠模型进一步观察了 CLMD对PDD大鼠病理及生化改变的影响,并基于腺苷酸活化蛋白激酶（Adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK）-哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白（Mammalian Target of Rapamycin,mTOR）信号通路从自噬角度探究了 CLMD对PDD发挥作用的可能分子机制,从而丰富CLMD治疗PDD的理论基础和实验依据。研究方法:网络药理学研究:应用 TCMSP、PubChem、Swiss ADME、Swiss Target Prediction 等数据库筛选“柴胡加龙骨牡蛎汤”各药物所含活性成分及相应靶点;应用GeneCards疾病数据库筛选“帕金森病”、“抑郁”相关疾病靶点;利用在线韦恩图绘制平台Venny 2.1筛选药物与疾病的共同靶点;应用String数据库、Cytoscape软件对药物与疾病的共同靶点进行PPI网络构建以进一步筛选出核心靶点;应用DAVID数据平台进行GO分析和KEGG通路富集分析以获取CLMD治疗PDD的可能作用靶点和相关通路,并应用Cytoscape软件构建“药物-成分-靶点-通路”网络。实验研究:1采用长期低剂量颈背部皮下注射鱼藤酮联合慢性不可预见性温和应激方法建立PDD大鼠模型,并随机分为6组:正常组、模型组、西药组、CLMD低剂量组、CLMD中剂量组、CLMD高剂量组,予以相应药物灌胃治疗,正常组和模型组予以等量生理盐水灌胃,连续4周。2行为学实验:观察PDD大鼠抑郁及运动行为变化;3高效液相色谱法:检测脑脊液中神经递质多巴胺（Dopamine,DA）、5-羟色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）、谷氨酸（Glutamate,Glu）、γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid,GABA）的含量变化;4 HE染色法:检测中脑黑质致密部DA能神经元的病理改变;5尼氏染色法:检测中脑黑质致密部尼氏小体,评估DA能神经元的活性;6免疫组化法:检测中脑黑质致密部及纹状体中酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase,TH）的表达;7免疫荧光法:检测中脑黑质致密部及纹状体中α-突触核蛋白（α-synuclein,α-syn）的表达;8 Western blot法:检测纹状体中微管相关蛋白1轻链3（Microtubule associated protein 1 lightchain 3,LC3）、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR 的表达。研究结果:网络药理学研究:共筛选出“柴胡加龙骨牡蛎汤”相关药物靶点770个,“帕金森病”、“抑郁”相关疾病靶点12608个,获得药物与疾病共同靶点506个,通过PPI网络构建进一步筛选出AKT、MTOR、PTEN、MAPK、HIF-1、VEGF 等核心靶点 33 个,GO 富集分析获得 404个GO条目,包括生物过程317个,细胞组成34个,分子功能53个,涉及细胞自噬、凋亡、增殖、蛋白磷酸化等过程,KEGG富集分析共筛选出mTOR、FOXO、PI3K-Akt、HIF-1、MAPK、VEGF等20条可能性较高的信号通路。实验研究:1行为学实验:与正常组比较,模型组大鼠水平运动总距离及中央区域活动时间明显减少（P＜0.01,P＜0.01）,爬杆时间明显缩短（P＜0.01）,爬杆评分升高（P＜0.01）;与模型组比较,CLMD高剂量组和西药组水平运动总距离和中央区域活动时间明显增加（P＜0.01,P＜0.01）,爬杆时间明显增加（P＜0.05,P＜0.05）,爬杆评分显著降低（P＜0.05,P＜0.01）。2高效液相色谱检测:与正常组比较,模型组大鼠脑脊液中DA、5-HT含量均明显降低（P＜0.01,P＜0.05）,Glu含量显著增加（P＜0.01）,GABA含量明显减少（P＜0.05）;与模型组比较,CLMD高剂量组及西药组DA、5-HT含量明显增加（P＜0.01,P＜0.01）,Glu含量显著减少（P＜0.05,P＜0.01）,GABA含量明显增加（P＜0.05,P＜0.05）,CLMD中剂量组5-HT含量增加（P＜0.05）。3 HE染色:与正常组比较,模型组大鼠黑质致密部DA能神经元数量明显减少,且胞体明显皱缩变形,边界模糊,排列疏松散乱,染色加深;与模型组比较,CLMD各组DA能神经元数量随给药剂量增加而逐渐增多,胞体有所增大,CLMD高剂量组DA能神经元数量明显增加,边界较为清晰,且排列趋于整齐,西药组DA能神经元数量及形态改善并不明显。4尼氏染色:与正常组比较,模型组大鼠黑质致密部DA能神经元中尼氏小体数量明显减少,染色变浅,细胞结构不完整,核仁模糊,细胞边界不清晰,蓝紫色物质分布散乱;与模型组比较,CLMD高剂量组尼氏小体数量增多明显,且细胞轮廓更为清晰,蓝紫色物质分布趋于集中中剂量组较低剂量组染色较浅,但蓝紫色物质的分布更趋于集中,西药组DA能神经元轮廓清晰,核仁明显,但尼氏小体数量增多不明显。5免疫组化检测:与正常组比较,模型组大鼠黑质致密部及纹状体TH阳性表达明显减少（P＜0.01,P＜0.01）;与模型组比较,CLMD高剂量组和西药组TH阳性表达均显著增加（P＜0.01,P＜0.01）。6免疫荧光检测:与正常组比较,模型组大鼠黑质致密部及纹状体中α-syn荧光表达明显增强（P＜0.01,P＜0.01）;与模型组比较,CLMD高剂量组和西药组α-syn荧光表达均减弱（P＜0.05,P＜0.01）。7Western blot检测:与正常组比较,模型组大鼠纹状体中LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ、p-AMPK/AMPK蛋白表达量明显降低（P＜0.05,P＜0.01）,p-mTOR/mTOR蛋白表达量显著增加（P＜0.01）;与模型组比较,CLMD高剂量组和西药组LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ蛋白表达明显增加（P＜0.05,P＜0.01）,p-mTOR/mTOR蛋白表达量显著减少（P＜0.01,P＜0.01）,CLMD中、高剂量组和西药组p-AMPK/AMPK蛋白表达量均显著增加（P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01）。结论及意义:网络药理学研究:CLMD治疗PDD的作用机制可能与自噬调节有关,涉及FOXO、PI3K-Akt、MAPK、mTOR等信号通路,AKT、MTOR、PTEN、MAPK、HIF-1、VEGF等可能为其发挥作用的关键靶点。实验研究:CLMD可改善PDD大鼠的运动功能和抑郁样行为,同时调节DA、5-HT、Glu、GABA等神经递质水平;CLMD可能通过调控AMPK-mTOR信号通路,激活自噬途径,抑制α-syn的异常聚集,增加TH的表达,保护中脑黑质致密部DA能神经元,从而发挥对PDD的治疗作用;CLMD高剂量组较低、中剂量组的神经保护作用更为显著。