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研究目的本课题延续团队前期的研究内容。一方面,从中医的角度深入探讨肾与脑的相关性,为临床脑发育障碍从肾论治提供中医理论依据;另一方面,沿用先天肾虚仔鼠模型,率先以含血小板反应蛋白的解聚蛋白样金属蛋白酶（ADAMTS-4）剪切调控摇晃蛋白（Reelin）为切入点,研究Reelin信号通路上下游相关因子在大脑发育过程中对神经元迁移的影响及作用,进一步明确先天肾虚仔鼠脑发育过程中神经元异常迁移原因及肾调控脑发育的可能机制,为相关神经系统疾病的预防和治疗提供实验依据。研究方法（1）理论研究:采用原著学习、文献检索等方法,系统搜集、整理、分析有关肾、脑方面的理论阐述、文献与研究进展,并在此基础上予以总结提炼。（2）实验研究:（1）实验采用3月龄SPF级SD大鼠,雌性40只,雄性20只,雌雄配对。受孕后的雌鼠取前33只随机分为3组:对照组、模型组、补肾组,每组11只。模型组和补肾组每日采用包括模拟地震和包天桐的悬吊应激法等恐吓为主的复合应激法刺激孕鼠,以复制先天肾虚仔鼠模型。自妊娠第一天起,补肾组孕鼠予以左归丸混悬液灌胃,对照组和模型组孕鼠每日予生理盐水灌胃。（2）采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测孕鼠血清、出生当天（D0）仔鼠血清、D0仔鼠脑皮质的游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）、游离甲状腺素（FT4）表达水平;苏木精-伊红染色法（HE）观察D0仔鼠大脑皮质层形态;免疫荧光双染法检测孕15天（E15）胎鼠和D0仔鼠脑皮质双皮质素（DCX）、脑脂结合蛋白（BLBP）蛋白表达。（3）分别采用蛋白质印迹法（WB）和逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）法,检测先天肾虚D0仔鼠大脑皮质ADAMTS-4、Reelin蛋白和m RNA表达。（4）分别采用WB法和RT-PCR法检测先天肾虚D0仔鼠大脑皮质Reelin信号通路下游相关分子:残障蛋白1（Dab1）、Fyn、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）蛋白和m RNA表达。（5）观察先天肾虚D21仔鼠一般情况;测量仔鼠体重、体长和脑湿重;Morris水迷宫检测D21仔鼠学习记忆能力;分别在光镜和电镜下观察D21仔鼠大脑皮质层神经元;分别用WB法和RT-PCR法检测D21仔鼠大脑皮质ADAMTS-4、Reelin、Fyn蛋白和m RNA表达。研究结果（1）理论研究:课题从中医学的角度对肾与脑的关系进行理论阐述,认为肾与脑在属性上阴阳相济;生理特性均“藏而不泻”;物质基础相互联通;生理功能相互协调;病理上相互影响;在治疗上补肾以益脑。（2）实验研究:（1）孕鼠血清FT3含量:各时段比较无统计学差异（P＞0.05）。与对照组比较,模型组产仔当天FT3含量显著上升（P＜0.01）;与模型组比较,补肾组含量显著下降（P＜0.01）。孕鼠血清FT4含量:对照组各时段比较无统计学差异（P＞0.05）,模型组呈下降趋势（P＜0.01）,补肾组呈下降趋势（P＜0.05）。与对照组比较,模型组产仔当天血清FT4含量显著降低（P＜0.01）;与模型组比较,补肾组显著升高（P＜0.01）。D0仔鼠血清FT3含量:各组比较无统计学差异（P＞0.05）。D0仔鼠血清FT4含量:与对照组比较,模型组、补肾组血清FT4含量明显降低（P＜0.01,P＜0.05）;与模型组比较,补肾组明显升高（P＜0.01）。D0仔鼠脑皮质层FT3表达:各组比较无统计学差异（P＞0.05）。D0仔鼠脑皮质层FT4表达:与对照组比较,模型组、补肾组FT4含量显著降低（P＜0.01,P＜0.05）;与模型组比较,补肾组明显升高（P＜0.01）。E15胎鼠脑皮质层形态学观察:对照组皮层结构清楚,层次清晰。模型组皮层结构紊乱,分子层明显增宽,胞体扭曲,染色质异常聚集,神经元细胞轴突走向紊乱。补肾组与模型组比较,结构较清晰,分子层间隙缩短、神经元数量增加。D0仔鼠脑皮质层形态学观察:对照组脑皮质层神经元排列清晰有序。模型组最外层分子层明显增宽,外颗粒层、椎体细胞层神经元排列杂乱,细胞间隙增大,神经元数量减少且胞体皱缩。补肾组神经细胞排列整齐,分子层、外颗粒层、椎体细胞层结构清晰,与模型组比较神经元数量增加（P＜0.05）。E15胎鼠和D0仔鼠大脑皮质层DCX、BLBP表达:模型组DCX、BLBP阳性表达荧光强度降低,阳性表达细胞减少;与模型组相比,补肾组DCX、BLBP阳性表达细胞增多,荧光强度升高。（2）D0仔鼠大脑皮质ADAMTS-4、Reelin蛋白含量:与对照组比较,模型组ADAMTS-4蛋白表达量明显升高（P＜0.01）,Reelin蛋白表达量明显降低（P＜0.01）;与模型组相比,补肾组ADAMTS-4蛋白表达量明显降低（P＜0.01）,Reelin蛋白表达量明显升高（P＜0.01）。D0仔鼠大脑皮质ADAMTS-4、Reelin m RNA含量:与对照组比较,模型组ADAMTS-4 m RNA含量明显升高,Reelin m RNA含量明显降低（P＜0.01,P＜0.05）;与模型组相比,补肾组ADAMTS-4 m RNA含量明显降低（P＜0.05）,Reelin m RNA含量明显升高（P＜0.05）。（3）D0仔鼠大脑皮质Dab1、Fyn和PI3K蛋白含量:与对照组比较,模型组Dab1、Fyn和PI3K蛋白表达明显下降（P＜0.01,P＜0.01,P＜0.05）;与模型组相比,补肾组Dab1、Fyn和PI3K蛋白表达显著升高（P＜0.01,P＜0.05,P＜0.05）。D0仔鼠大脑皮质Dab1、Fyn和PI3K m RNA含量:与对照组比较,模型组Dab1、Fyn和PI3K m RNA含量明显下降（P＜0.01,P＜0.01,P＜0.05）;与模型组相比,补肾组Dab1、Fyn和PI3K m RNA含量明显升高（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.05）。（4）D21仔鼠一般情况:对照组仔鼠一般状态较好,被毛红润顺滑,活动度较高,食欲好,饮水量正常,小便色、量均正常,大便干稀适中。与对照组比较,模型组仔鼠被毛杂乱、偏暗没有光泽,易惊恐、小便次数增多,大便稀软,部分仔鼠有无尾畸形或被毛脱落的现象,体重减轻（P＜0.05）,体长缩短（P＜0.05）,脑湿重、脑重指数降低（P＜0.05）。与模型组比较,补肾组仔鼠二便基本正常,被毛有轻微枯黄无光泽,未见明显的脱毛现象,体重增加（P＜0.05）,体长增长（P＜0.05）,脑湿重、脑重指数升高（P＜0.05）。D21仔鼠学习记忆能力:与对照组比较,模型组D21仔鼠逃避潜伏期明显延长（P＜0.01）,穿越次数减少（P＜0.05）,在第3目标象限停留百分比缩短（P＜0.01）;与模型组比较,补肾组逃避潜伏期缩短（P＜0.01）,穿越次数增多（P＜0.05）,目标象限停留百分比提高（P＜0.01）。D21仔鼠大脑皮质神经元形态:模型组仔鼠大脑皮质最外层分子层明显增宽,细胞间隙增大,神经元排列杂乱、胞体皱缩、数量减少,神经元结构凹凸不平,核形不规则,核膜缺损,线粒体断裂,胞质内可见凋亡小体;与模型组比较,补肾组神经元数量增加,细胞排列整齐,各层结构清晰,神经细胞结构较完整,核膜较光滑、清晰,染色质均匀分布。D21仔鼠大脑皮质ADAMTS-4、Reelin、Fyn蛋白含量:与对照组比较,模型组仔鼠ADAMTS-4蛋白表达量明显升高（P＜0.01）,Reelin、Fyn蛋白表达量明显降低（P＜0.05,P＜0.01）;与模型组比较,补肾组ADAMTS-4蛋白表达量降低（P＜0.05）,Reelin、Fyn蛋白表达量升高（P＜0.05）。D21仔鼠大脑皮质ADAMTS-4、Reelin、Fyn m RNA含量:与对照组比较,模型组仔鼠ADAMTS-4 m RNA含量升高（P＜0.05）,Reelin、Fyn m RNA含量降低（P＜0.01,P＜0.05）;与模型组比较,补肾组ADAMTS-4 m RNA含量降低（P＜0.05）,Reelin、Fyn m RNA含量升高（P＜0.05）。研究结论（1）肾脑密切相关,脑病从肾论治具有丰富的中医理论支持和广泛的临床实践。（2）实验采用“恐伤孕鼠”的方法复制出先天肾虚仔鼠模型,并发现先天肾虚可通过降低甲状腺激素（TH）水平,减少放射状胶质细胞（RGC）数量或减少DCX表达抑制大脑皮质神经元迁移,从而影响脑发育。（3）ADAMTS-4对Reelin剪切调控异常导致Reelin不能正常与载脂蛋白E受体2（Apo ER2）和极低密度脂蛋白受体（VLDLR）结合并激活下游通路,下游Dab1、Fyn、PI3K表达下降,是先天肾虚仔鼠大脑皮质发育异常的重要原因之一。（4）在孕期采用左归丸填补母鼠肾精,可以增加FT4水平、RGC数量和DCX表达;抑制大脑中ADAMTS-4表达,增强Reelin表达和活性;增加Reelin信号通路下游Dab1、Fyn、PI3K表达,从而缓解先天肾虚仔鼠脑前额皮质神经元异常迁移而致分层结构紊乱的现象,促进脑皮质发育,并在一定程度上预防或缓解仔鼠生长发育迟缓和学习记忆能力低下。