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目的既往研究表明,补肾化痰方可调节骨代谢,纠正PMOP模型大鼠肠道菌群紊乱,其内在机制尚未明晰。本研究围绕肠道菌群代谢产物SCFAs丁酸、自噬活性和腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)/m TOR/unc-51样激酶1(Unc-51 like kinase 1,ULK1)信号通路,初步探索补肾化痰方改善骨代谢的机制是否与SCFAs丁酸对自噬的调控相关,进一步探究补肾化痰方防治PMOP的内在机制。方法(1)通过查阅古籍和国内外最新研究进展,基于中医基础理论,从理论层面探讨从补肾化痰方论治PMOP的理论源流和依据,明晰肠道菌群和细胞自噬与PMOP发病的潜在联系。(2)通过双侧卵巢切除术(ovariectomy,OVX)建立PMOP模型大鼠。随机分为模型组(OVX组,n=15),补肾化痰方组(BH组,n=15),LKB1-AMPK激活剂Metformin组(Met组,n=15),选取假手术组大鼠为阴性对照(Sham组,n=15)。以Micro-CT扫描骨组织观察补肾化痰方对PMOP模型大鼠骨微结构的影响,采用苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)观察补肾化痰方对PMOP模型大鼠骨形态的影响,联合抗酒石酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)组织化学染色、免疫组织化学染色观察补肾化痰方对PMOP模型大鼠骨吸收的影响。以流式细胞检测骨组织内活性氧(reactive oxygen species,ROS)表达,观察补肾化痰方对PMOP模型大鼠骨组织中氧化应激水平的影响。(3)结合16s r RNA扩增子测序和宏基因组测序,观察各组大鼠肠道菌群组成结构的差异,以及补肾化痰方干预对模型大鼠肠道菌群结构差异的影响,对菌群功能进行注释,获取PMOP模型大鼠差异菌群功能的多样性。采用靶向代谢组学技术,筛选各组大鼠粪便和血清中的短链脂肪酸含量,并对包括乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、己酸、异己酸在内的短链脂肪酸作定量检测,联合生物信息学方法分析差异代谢产物参与的代谢通路,明确补肾化痰方对PMOP模型大鼠肠道菌群代谢物的影响。(4)采用反转录荧光定量实验(Reverse transcription-polymerase,RT-PCR)和免疫蛋白印迹法(Western Blot,WB)检测大鼠骨组织中自噬相关基因和蛋白的表达水平和AMPK/m TOR/ULK1信号通路相关指标,观察PMOP模型大鼠自噬水平及补肾化痰方通过AMPK/m TOR/ULK1信号通路对模型大鼠自噬活性的影响。结果(1)“肾痰”是肾脏虚衰导致水液代谢失常的病理产物。“肾痰”累骨,见筋骨不利,腰背强痛,足膝酸软,正合PMOP发病与临床表现。因此,肾虚生痰,痰浊入骨,是PMOP发病的关键因素之一。通过文献研究发现,国内外多项研究提示肠道菌群和细胞自噬均参与PMOP的发病,但肠道菌群代谢产物SCFAs介导的m TOR靶点调控细胞自噬是否参与调节骨代谢有待探索发现。从中医学角度认识肠道微生物的稳态和适度水平的细胞自噬,认为其有利于维持机体生命活动的有序,而中医药多途径平衡肠道菌群和调节细胞自噬具有一定的理论与科学依据。(2)Micro-CT结果显示:与Sham组比较,OVX组大鼠胫骨的骨密度(bone mineral density,BMD)、骨小梁数量(Trabecular Number,Tb.N)、骨小梁厚度(Trabecular Thickness,Tb.Th)及相对骨体积(Bone Volume/Total Volume,BV/TV)显著降低(P<0.05),骨小梁分离度(Trabecular Spacing,Tb.Sp)、骨小梁表面积/骨容量百分比(Bone Surface/Bone Volume,BS/BV)显著增加(P<0.05)。与OVX组相比,BH组和Met组大鼠胫骨的BMD、Tb.N、Tb.Th、BV/TV显著改善(P<0.05),Tb.sp、BS/BV显著降低(P<0.05)。染色结果显示:与Sham组比较,OVX组大鼠的股骨破骨细胞数量显著增加(P<0.05);BH组和Met组大鼠破骨细胞数量显著减少与OVX组(P<0.05)。流式细胞检测OVX组大鼠骨组织中活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平显著高于Sham组(P<0.05),BH组和Met组大鼠骨组织中ROS表达显著低于OVX组(P<0.05)。(3)肠道菌群测序结果显示:Sham组大鼠肠道菌群多样性优于OVX组,BH组和Met组大鼠肠道菌群多样性优于OVX组。物种分类学显示,在门水平上,与Sham组对比,OVX组中厚壁菌门丰度降低,拟杆菌门、变形菌门、柔膜菌门比例上升。与OVX组比,BH组和Met组大鼠肠道菌群拟杆菌门、变形菌门丰度减少,厚壁菌门丰度增加。在属水平上,与Sham组比,OVX组大鼠拟杆菌属、瘤胃菌属(Ruminococcaceae_UCG-005)丰度增加,梭菌属、乳杆菌属、毛螺菌属、瘤胃菌属、Odribactor减少;与OVX组比,BH组和Met组瘤胃菌属、梭菌属、乳杆菌属、毛螺菌属、Odribactor丰度增加,拟杆菌属、瘤胃菌属(Ruminococcaceae_UCG-014)减少。在种水平上,与Sham组大鼠比较,OVX组大鼠Marvinbryantia_formatexigens丰度上升,厚壁杆菌、梭状芽胞杆菌、厚壁杆菌丰度下降,给药后Marvinbryantia_formatexigens丰度下降,而厚壁杆菌、梭状芽胞杆菌丰度相对升高。基于KEGG数据库对各组大鼠进行肠道菌群功能预测,发现差异菌群功能与胆汁酸代谢、短链脂肪酸转运、支链氨基酸转运系统通透酶蛋白、乙酸激酶、丙酸激酶、丁酸激酶相关。(4)靶向代谢组学结果表明:OVX组大鼠粪便和血清中代谢产物与Sham组大鼠样本明显分离,BH组和Met组大鼠粪便和血清中代谢产物略靠近与Sham组。SCFAs定量结果显示,与Sham组比较,OVX组大鼠粪便组织和血清样本中总SCFAs含量明显减少(P<0.05)。BH组和Met组大鼠粪便和血清中总SCFAs含量略有升高(P<0.05)。乙酸、丙酸、丁酸含量占据总SCFAs含量的90%。与Sham组比,OVX组大鼠粪便组织和血清样本中乙酸、丙酸、丁酸含量则显著下降(P<0.05)。BH组和Met组大鼠粪便组织和血清样本中乙酸、丙酸、丁酸含量升高(P<0.05)。(5)与Sham组相比,OVX组大鼠AMPK、p-AMPK、m TOR、p-m TOR、ULK1、自噬相关基因(autophagy-related gene,ATG)13蛋白与基因表达无显著差异(P>0.05),在给药干预后,BH组和Met组大鼠骨组织中AMPK、p-AMPK、ULK1、ATG13表达水平显著高于Sham组和OVX组(P<0.05),且m TOR、p-m TOR表达水平下调(P<0.05)。自噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62蛋白表达与基因表达水平在Sham组和OVX组中无统计学差异,BH组和Met组中Beclin1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达与基因的表达显著高于OVX组和Sham组(P<0.05),p62水平显著下降(P<0.05)。结论1.肾虚生痰,肾痰在骨是PMOP发病的关键因素之一。从“肾痰”论治PMOP,在补肾的基础上化痰,是符合中医学辨证论治的治疗法则。现代研究表明中医药立调节细胞自噬和肠道菌群具有一定的理论依据和科学基础。2.补肾化痰方可有效改善PMOP模型大鼠骨微结构,提高模型大鼠骨组织中抗氧化能力,其作用同改善PMOP模型大鼠肠道菌群紊乱,增加PMOP模型大鼠肠道内SCFAs产生菌的丰度及含量,促进粪便和血清中丙酸、丁酸、乙酸的含量,通过AMPK/m TOR/ULK1信号通路促进PMOP模型大鼠体内自噬水平有关。