背景与目的腓骨肌萎缩症（Charcot-Marie-Tooth（CMT））是指以慢性运动和感觉发型神经病变为特征的常见遗传疾病,故也被称为遗传性运动和感觉神经病变。CMT发现已有130年,已报道的致病基因有90多个,统计发现仍有近30%的CMT患者未能找到致病基因。发病率约为1/2500,其诊断主要依据临床表现、神经电生理检查及家系资料等。通常的临床表征是十到三十岁发生进行性的远端运动神经病变,导致脚和手肌肉的无力和萎缩。受影响的个体通常症状为远端肌肉无力和萎缩,踝关节背屈无力,肌腱反射凹陷,伴有脚部畸形,偶见听力缺失。在前期研究中,我们通过两个来自江苏和湖南的腓骨肌萎缩症家系分析,定位克隆了一个新的腓骨肌萎缩症致病基因C1ORF194。我们在细胞水平研究了C1ORF194蛋白在体外细胞的表达、降解、定位等功能性特征,同时构建了基因敲入小鼠模型,表型分析发现其运动和感觉能力受到明显影响,各项行为学、生理学指标下降,组织学形态学观察也提示其产生了腓骨肌萎缩症。此外,我们还对该基因在小鼠神经细胞的功能及致病机制进行了初步探究。本课题为了进一步研究C1ORF194的功能及其与腓骨肌萎缩症疾病的关系,我们构建基因敲除C1orf194小鼠,通过对比野生型、杂合子及纯合子小鼠的行为学、生理学指标,观察组织形态学变化,探究C1orf194缺失对小鼠个体的发育、行为、运动和感觉能力影响。另外,通过原代培养小鼠运动神经元初步探究C1orf194缺失对小鼠神经元细胞的影响,探究其缺失导致外周神经病变产生腓骨肌萎缩症的分子机制。材料与方法1.运用CRISPR-Cas9和Cre-loxp技术构建了C1orf194基因敲除小鼠;2.提取鼠尾gDNA进行PCR和Sanger测序及琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型,利用实时荧光定量 PCR（real-time quantitative reverse transcription PCR,qRT-PCR）和蛋白质印迹法（免疫印迹试验,Western Blot）验证基因表达变化;3.行为学实验检测运动和感觉能力;4.电生理实验检测坐骨神经动作电位幅度和神经传导速度变化;5.坐骨神经超薄切片,透射电镜观察坐骨神经轴突,髓鞘和施旺细胞线粒体的变化;6.石蜡切片,尼氏染色观察脊髓前角,苏木精-伊红染色法观察（HE染色）观察腓肠肌的组织形态学变化;7.单根坐骨神经分离,制作切片,染色,观察神经纤维结构变化;8.分离,纯化,培养,得到原代培养的小鼠施旺细胞,检测其细胞器形态;9.孕鼠子宫解剖,观察E7.5-10.5天胚胎晚期内体室,胚胎与胎盘形态。研究结果成功构建了C1orf1 94+/-小鼠,繁育扩大得到了野生型,中间型,纯合突变型小鼠。行为学实验中步态、滚轴、抓力、痛阈等指标都显著下降,突变型小鼠的运动和感觉能力下降,出现了与腓骨肌萎缩症病人相似表型,其中纯合突变型于四月龄左右起发病,中间型于六月龄左右发病。电生理测定发现突变型小鼠的复合动作电位幅度下降,神经传导速度也下降。透射电镜下观察坐骨神经出现了轴突退化,脱髓鞘现象,轴突内线粒体出现肿胀,内容质嵴减少等异常。尼氏染色的脊髓前角中运动神经元数量下降。HE染色的腓肠肌纤维出现萎缩现象。单根坐骨神经分离染色观察发现郎飞氏结间距离变短,施兰切迹间距变短,施旺细胞出现多核现象。原代培养小鼠施旺细胞成功,线粒体形态存在异常。结论1.本研究成功的构建了C1orf194基因敲除小鼠,纯合突变小鼠坐骨,脊髓,腓肠肌组织无Clorf194蛋白表达。2.我们在行为学实验中发现了突变型小鼠的运动和感觉能力缺陷;电生理指标下降提示神经传导能力缺陷;脊髓运动神经元数量减少进一步提示小鼠的运动能力受损,腓肠肌纤维萎缩说明肌肉受累;坐骨神经结构也发生异常,g-ratio显著下降,轴突出现退化;脱髓鞘比例大幅上升;坐骨神经郎飞氏结,施兰切迹,施旺细胞的变化验证了坐骨神经传导速度减慢的事实;纯合突变型小鼠的病症较中间型更重,发病时间也更早,提示该蛋白对维持外周神经细胞有重要意义。3.原代培养小鼠施旺细胞成功后,检测到突变型施旺细胞的线粒体等亚细胞结构存在异常。提示其致病机制可能线粒体能量代谢与膜融合异常有关。4.C1ORF194基因为CMT疾病的显性致病基因,其突变将导致DI-CMT,遗传机制主要为单倍型不足,但某些点突变产生的某些异常结构蛋白也可致病。