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研究背景:脓毒症（Sepsis）是机体由感染所引发的全身炎症反应综合征,具有较高的发生率和死亡率,严重危害人类的生命健康。急性肺损伤（acute lung injury,ALI）在脓毒症发生过程中出现最早,通过损伤肺泡上皮细胞和血管内皮细胞,导致肺脏出现严重的功能障碍,大大降低了患者的生活质量。脓毒症发生时,炎性介质高迁移率组蛋白1（high mobility group protein,HMGB1）大量释放,并可与晚期糖基化终末产物受体（receptor for advanced glycation end products,RAGE）结合,进一步激活下游信号通路,从而损伤肺泡上皮细胞,导致肺上皮通透性增加。实验室前期通过对脓毒症休克小鼠肺脏进行差异蛋白组学分析,筛选出目的蛋白角蛋白7（Krt7）。课题组前期实验结果已证明Krt7作为上皮细胞的骨架蛋白,参与调控HMGB1介导的肺泡上皮细胞通透性增高的过程。另外,多种翻译后修饰参与调节角蛋白中间丝,目前研究最多的是角蛋白的磷酸化。有研究表明,p38 MAPK参与调节上皮细胞中Krt8的第73位丝氨酸的磷酸化。Krt7同为Ⅱ型角蛋白,因此我们假设p38 MAPK通过调节肺泡上皮细胞中Krt7的磷酸化参与细胞骨架的重构。有研究表明,桥粒蛋白（desmosomes）可以将角蛋白中间丝锚定在细胞膜上,从而参与调控上皮细胞的屏障功能。上皮细胞的完整性依赖于角蛋白中间丝和桥粒蛋白所形成的复合物,桥粒蛋白的稳定性主要取决于角蛋白中间丝网络结构的完整性。有研究表明,Ⅱ型角蛋白5与桥粒蛋白形成复合物,对于维持表皮的屏障功能有重要作用,所以我们假设Krt7与桥粒蛋白也可以形成复合物,从而维持肺泡上皮细胞的屏障功能的稳定。有研究表明,HMGB1和RAGE结合可以通过哺乳动物成蛋白1（mammalian diaphanous 1,mDia1）激活细胞分裂周期蛋白42（cell division cycle protein42,Cdc42）,参与调节细胞骨架重构。前期实验已经证明Cdc42参与调节HMGB1介导的p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）的磷酸化,而且RAGE/mDia1/Cdc42/p38 MAPK参与HMGB1介导的A549细胞通透性增高的过程。综上所述,我们假设HMGB1与RAGE结合后通过mDia1激活Cdc42,使得p38 MAPK发生磷酸化,进一步使得Krt7发生磷酸化,角蛋白骨架发生重构,从而通过Krt7-桥粒蛋白复合物的崩解来促进肺泡上皮细胞通透性的增高,引发肺泡上皮细胞屏障功能障碍。研究目的:本研究的目的是探究Krt7和桥粒蛋白参与到HMGB1所介导的肺泡上皮细胞通透性增高的发生机制。方法:动物水平上,对C57小鼠和RAGE（-/-）小鼠进行盲肠结扎穿孔术（CLP）构建脓毒症模型,尾静脉注射伊文氏蓝（EB）检测肺组织中EB的浓度来反映肺泡上皮细胞的通透性;免疫组化检测肺上皮连接桥粒斑蛋白（Desmoplakin）的含量;透射电镜观察肺组织中桥粒蛋白的改变。细胞水平上,运用肺癌上皮细胞A549培养技术,用免疫印迹检测桥粒斑蛋白的含量;用免疫沉淀检测Krt7和p38MAPK的相互作用;用免疫荧光观察Krt7和桥粒斑蛋白的形态学改变以及Krt7和p38 MAPK的共定位;用RAGE/mDia1 siRNA干扰检测HMGB1是否通过RAGE/mDia1激活下游Cdc42;探究Krt7和桥粒蛋白如何参与调节HMGB1介导的肺泡上皮细胞通透性增高的过程。结果:1、RAGE参与脓毒症小鼠肺泡上皮细胞桥粒蛋白减少以及通透性增高的过程。采用盲肠结扎术构建脓毒症模型,术后12h,通过尾静脉注射伊文氏蓝（EB）,检测肺组织中伊文氏蓝（EB）的浓度。与WT-Sham组相比,WT-CLP组的肺组织中EB含量明显增高;与WT-CLP组相比,RAGE（-/-）-CLP组肺组织中EB的量增高不明显。表明RAGE参与脓毒症小鼠肺泡上皮细胞通透性增高的过程。分别硕士学位论文对小鼠肺组织桥粒蛋白进行免疫组化染色和透射电镜观察,结果显示,与WT-Sham组相比,WT-CLP组的小鼠肺组织中桥粒明显减少;与WT-CLP组相比,RAGE（-/-）-CLP组肺组织中桥粒的减少不明显。表明RAGE参与脓毒症小鼠肺泡上皮细胞桥粒蛋白减少的过程。2、Krt7参与维持上皮之间的连接桥粒斑蛋白（Desmoplakin）稳定。预转染Krt7 siRNA,按照分组给予100 ng/ml HMGB1刺激A549细胞12h,通过蛋白免疫印迹检测桥粒斑蛋白的含量。结果显示,与Control组相比,HMGB1组、NC siRNA+HMGB1组桥粒斑蛋白的含量显著下降,预转染Krt7 siRNA组桥粒斑蛋白的含量也明显下降,这表明Krt7对于维持上皮之间的连接桥粒斑蛋白的稳定性十分重要。3、RAGE/mDia1/Cdc42/p38 MAPK参与HMGB1介导的桥粒斑蛋白减少以及Krt7和桥粒斑蛋白共定位减少的过程。预转染RAGE/mDia1/Cdc42/p38 MAPK siRNA,按照分组给予 100 ng/ml HMGB1刺激A549细胞12h,通过蛋白免疫印迹检测桥粒斑蛋白的含量。结果显示,与Control组相比,HMGB1组、桥粒斑蛋白的含量显著下降,与HMGB1组相比,预转染RAGE/mDia1/Cdc42/p38 MAPK siRNA+HMGB1组桥粒斑蛋白的含量下降不明显,表明RAGE/mDia1/Cdc42/p38 MAPK参与HMGB1介导的桥粒斑蛋白减少的过程。另外,应用Cdc42抑制剂ML141以及p38的激活剂Anisomycin和p38抑制剂SB203580,通过蛋白免疫印迹检测桥粒斑蛋白的含量。结果显示,与Control组相比,HMGB1组和Anisomycin组桥粒斑蛋白的含量显著下降,与HMGB1组相比,ML141+HMGB1组和SB203580+HMGB1组桥粒斑蛋白的含量下降不明显。表明Cdc42/p38的激活参与HMGB1介导的桥粒斑蛋白减少的过程。按照以上分组,通过免疫荧光观察Krt7和桥粒斑蛋白共定位。结果显示,与Control组相比,HMGB1组Krt7和桥粒斑蛋白共定位明显减少;与HMGB1组相比,预转染RAGE/mDia1/Cdc42/p38 MAPK siRNA+HMGB1组Krt7和桥粒斑蛋白共定位没有明显减少,表明RAGE/mDia1/Cdc42/p38 MAPK参与HMGB1介导的Krt7和桥粒斑蛋白共定位减少的过程。4、RAGE/mDia1参与HMGB1介导A549细胞Cdc42以及p38的激活。分别转染RAGE/mDia1 siRNA和RAGE突变质粒,按照相应的分组对A549细胞给予 100 ng/ml HMGB1 刺激 0.5 h,与 Control 组相比,HMGB1 组GTP-Cdc42明显增多,表明Cdc42活性增强。与HMGB1组相比,转染RAGE/mDia1 siRNA+HMGB 1组和突变质粒+HMGB1组GTP-Cdc42没有明显的增多,表明RAGE/mDia1参与HMGB1介导A549细胞Cdc42的激活。与Control组相比,HMGB1组p-p38明显增多,表明p38活性增强。与HMGB1组相比,转染RAGE突变质粒+HMGB1组p-p38没有明显的增多,表明RAGE/mDia1参与HMGB1介导A549细胞p38的激活。5、HMGB1介导A549细胞p38 MAPK与Krt7的相互作用增强。通过免疫共沉淀和免疫荧光检测p38 MAPK和Krt7之间的相互作用。免疫共沉淀结果显示,与Control组相比,HMGB1刺激后,用Krt7的IP抗体拉下的p38 MAPK的量明显增多;用p38 MAPK的IP抗体拉下的Krt7的量也明显增多。免疫荧光结果显示,与Control组相比,HMGB1刺激后,p38 MAPK和Krt7的共定位明显增加。表明HMGB1介导A549细胞p38 MAPK与Krt7的相互作用增强。结论:1、RAGE参与脓毒症小鼠肺泡上皮细胞桥粒蛋白减少以及通透性增高的过程。2、Krt7参与维持上皮之间的连接桥粒斑蛋白稳定。3、RAGE/mDia1/Cdc42/p38 MAPK参与HMGB1介导的A549细胞桥粒斑蛋白减少以及Krt7和桥粒斑蛋白共定位减少的过程。4、RAGE/mDia1参与HMGB1介导A549细胞Cdc42以及p38的激活。5、HMGB1介导A549细胞p38 MAPK与Krt7的相互作用增强。