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目的：
本实验用链脲佐菌素（STZ，Streptozocin）建立大鼠糖尿病模型，通过分离纯化近交系Lewis大鼠的胰岛，再导入碱性成纤维细胞生长因子（bFGF或FGF2，basicFibroblastGrowthFactor）后进行同系糖尿病Lewis大鼠门静脉的方法，研究该基因导入对移植后大鼠胰岛的功能和评价促微血管重建的作用。
方法：
1.建立糖尿病大鼠模型：采用雄性近交系Lewis大鼠，禁食过夜后腹腔注射2%链脲佐菌素（STZ，55mg/kg），72h后测血糖≥11.0mmol/L为糖尿病造模成功。造模后测量尾静脉的血糖值，观察大鼠体重及一般情况的变化。
2.大鼠胰岛细胞团的分离纯化：利用逆行胆总管灌注V型胶原酶法分离胰岛细胞团，并用Ficoll密度梯度液和手工挑选进行大鼠胰岛的纯化，鉴定胰岛细胞团的纯度、数量和当量，并对分离的胰岛进行扫描电镜和透射电镜的观察。
3.体外bFGF基因导入：将分离纯化的大鼠胰岛，经绿色荧光蛋白（GFP，GreenFluorescentProtein）质粒和带GFP基因的重组bFGF质粒腺病毒（Ad-r-bFGF-3*flag-GFP）转染，进行感染复数、感染率检测和活性检测。
4.基因导入后胰岛的体内移植：将成模大鼠分为实验组（胰岛经重组腺病毒基因转染移植组）5只，未感染组（单纯胰岛移植组）5只，均经肝门静脉注射途径；C组（对照组）5只，仅经肝门静脉注入等量CMRL1066胰岛培养液。定期测定大鼠血糖、糖耐量试验，并于第10天取肝脏，进行组织学和血小板-内皮细胞黏附分子（CD31，PlateletEndothelialCellAdhesionMolecule-1）蛋白表达评价。
结果：
1.经腹腔注射链脲佐菌素（STZ）后实验组大鼠血糖升高迅速，注射72h后，血糖值≥11.0mmol/L，有19只大鼠建模成功，成模率为95%。建模一周后，实验组大鼠的进食量、饮水量及排尿量均明显增加。出现消瘦、皮下组织减少、体重明显减轻的现象。
2.分离纯化后的Lewis大鼠胰岛形状为圆形或椭圆形大小不一的细胞团，大部分直径在50～500μm，每只大鼠的胰岛数量为563±135个，当量为687.4±215.3当量（IEQ，IsletEquivalentQuantity），胰岛边缘清晰，纯度＞95%。经培养6h后，胰岛界限清晰，经荧光素二乙酸酯-碘化丙啶（FDA-PI，FluoresceinDiacetate-PropidiuIodide）染色后胰岛活性为89.6±3.5%。扫描电镜结果显示新纯化后的大鼠胰岛虽然整体完整，但被膜有一定程度的损坏，经培养48h后，胰岛变得外形圆整、光滑。透射电镜结果显示新纯化后的大鼠胰岛表面无被膜包裹，细胞团内部血管壁不完整；分泌颗粒数量依然较多，但部分线粒体内部嵴不清晰。
3.在感染复数（MOI，multiplicityofinfection）条件摸索中，各GFP基因腺病毒感染组胰岛经培养后外形依然完整，边界清晰，圆整度较好，并在蓝光下均能发出绿色荧光，50、100、200MOIGFP质粒感染率分别为48.6±5.8%、77.4±6.5%和82.3±4.9%；培养12h后对照组、MOI50、MOI100、MOI200的GFP腺病毒基因转染后的大鼠胰岛的活性分别为91.7±3.1%、90.8±4.6%、89.5±3.7%、87.7±6.5%；各腺病毒感染组胰岛的活性与对照组无显著性差异（P＞0.05）。经100MOIAd-r-bFGF-3*flag-GFP基因转染后的大鼠胰岛培养后的活性为87.8±5.7%。
4.经大鼠肝门静脉移植1200±200IEQ胰岛后，实验组和未转染基因组血糖均基本得以控制，证实了转基因bFGF大鼠胰岛能达到降血糖的功效；体重也逐渐增加；口服糖耐量试验（OGTT，OralGlucoseToleranceTest）显示实验组大鼠和未转基因组大鼠在灌胃葡萄糖后血糖升高峰值明显低于对照组糖尿病大鼠（P＜0.001），并变化趋势与正常组大鼠接近，说明两组大鼠移植后的胰岛功能均良好。组织学结果显示两组大鼠肝内的胰岛活性良好，胰岛素分泌旺盛。免疫蛋白印迹（WB，WestenBlot）检测结果显示实验组胰岛移植后第10d胰岛的CD31表达高于非转染组胰岛细胞团移植后。
结论：
链脲佐菌素是制备糖尿病动物模型较为理想的药物，造模稳定、快速。采用逆行胆总管灌注V型胶原酶溶液，再经聚蔗糖Ficoll-1119，Ficoll-1077和Hanks液纯化，可获得高纯度、活性好、数量多的大鼠胰岛。采用腺病毒为载体，将100MOIAd-r-bFGF-3*flag-GFP基因转染到大鼠胰岛，可以得到较高的转染率。1200±200IEQ转基因胰岛经大鼠门静脉内移植，能获得良好的血糖控制效果，并提高胰岛的功能和促进移植后胰岛的微血管重建。
本实验用链脲佐菌素（STZ，Streptozocin）建立大鼠糖尿病模型，通过分离纯化近交系Lewis大鼠的胰岛，再导入碱性成纤维细胞生长因子（bFGF或FGF2，basicFibroblastGrowthFactor）后进行同系糖尿病Lewis大鼠门静脉的方法，研究该基因导入对移植后大鼠胰岛的功能和评价促微血管重建的作用。
方法：
1.建立糖尿病大鼠模型：采用雄性近交系Lewis大鼠，禁食过夜后腹腔注射2%链脲佐菌素（STZ，55mg/kg），72h后测血糖≥11.0mmol/L为糖尿病造模成功。造模后测量尾静脉的血糖值，观察大鼠体重及一般情况的变化。
2.大鼠胰岛细胞团的分离纯化：利用逆行胆总管灌注V型胶原酶法分离胰岛细胞团，并用Ficoll密度梯度液和手工挑选进行大鼠胰岛的纯化，鉴定胰岛细胞团的纯度、数量和当量，并对分离的胰岛进行扫描电镜和透射电镜的观察。
3.体外bFGF基因导入：将分离纯化的大鼠胰岛，经绿色荧光蛋白（GFP，GreenFluorescentProtein）质粒和带GFP基因的重组bFGF质粒腺病毒（Ad-r-bFGF-3*flag-GFP）转染，进行感染复数、感染率检测和活性检测。
4.基因导入后胰岛的体内移植：将成模大鼠分为实验组（胰岛经重组腺病毒基因转染移植组）5只，未感染组（单纯胰岛移植组）5只，均经肝门静脉注射途径；C组（对照组）5只，仅经肝门静脉注入等量CMRL1066胰岛培养液。定期测定大鼠血糖、糖耐量试验，并于第10天取肝脏，进行组织学和血小板-内皮细胞黏附分子（CD31，PlateletEndothelialCellAdhesionMolecule-1）蛋白表达评价。
结果：
1.经腹腔注射链脲佐菌素（STZ）后实验组大鼠血糖升高迅速，注射72h后，血糖值≥11.0mmol/L，有19只大鼠建模成功，成模率为95%。建模一周后，实验组大鼠的进食量、饮水量及排尿量均明显增加。出现消瘦、皮下组织减少、体重明显减轻的现象。
2.分离纯化后的Lewis大鼠胰岛形状为圆形或椭圆形大小不一的细胞团，大部分直径在50～500μm，每只大鼠的胰岛数量为563±135个，当量为687.4±215.3当量（IEQ，IsletEquivalentQuantity），胰岛边缘清晰，纯度＞95%。经培养6h后，胰岛界限清晰，经荧光素二乙酸酯-碘化丙啶（FDA-PI，FluoresceinDiacetate-PropidiuIodide）染色后胰岛活性为89.6±3.5%。扫描电镜结果显示新纯化后的大鼠胰岛虽然整体完整，但被膜有一定程度的损坏，经培养48h后，胰岛变得外形圆整、光滑。透射电镜结果显示新纯化后的大鼠胰岛表面无被膜包裹，细胞团内部血管壁不完整；分泌颗粒数量依然较多，但部分线粒体内部嵴不清晰。
3.在感染复数（MOI，multiplicityofinfection）条件摸索中，各GFP基因腺病毒感染组胰岛经培养后外形依然完整，边界清晰，圆整度较好，并在蓝光下均能发出绿色荧光，50、100、200MOIGFP质粒感染率分别为48.6±5.8%、77.4±6.5%和82.3±4.9%；培养12h后对照组、MOI50、MOI100、MOI200的GFP腺病毒基因转染后的大鼠胰岛的活性分别为91.7±3.1%、90.8±4.6%、89.5±3.7%、87.7±6.5%；各腺病毒感染组胰岛的活性与对照组无显著性差异（P＞0.05）。经100MOIAd-r-bFGF-3*flag-GFP基因转染后的大鼠胰岛培养后的活性为87.8±5.7%。
4.经大鼠肝门静脉移植1200±200IEQ胰岛后，实验组和未转染基因组血糖均基本得以控制，证实了转基因bFGF大鼠胰岛能达到降血糖的功效；体重也逐渐增加；口服糖耐量试验（OGTT，OralGlucoseToleranceTest）显示实验组大鼠和未转基因组大鼠在灌胃葡萄糖后血糖升高峰值明显低于对照组糖尿病大鼠（P＜0.001），并变化趋势与正常组大鼠接近，说明两组大鼠移植后的胰岛功能均良好。组织学结果显示两组大鼠肝内的胰岛活性良好，胰岛素分泌旺盛。免疫蛋白印迹（WB，WestenBlot）检测结果显示实验组胰岛移植后第10d胰岛的CD31表达高于非转染组胰岛细胞团移植后。
结论：
链脲佐菌素是制备糖尿病动物模型较为理想的药物，造模稳定、快速。采用逆行胆总管灌注V型胶原酶溶液，再经聚蔗糖Ficoll-1119，Ficoll-1077和Hanks液纯化，可获得高纯度、活性好、数量多的大鼠胰岛。采用腺病毒为载体，将100MOIAd-r-bFGF-3*flag-GFP基因转染到大鼠胰岛，可以得到较高的转染率。1200±200IEQ转基因胰岛经大鼠门静脉内移植，能获得良好的血糖控制效果，并提高胰岛的功能和促进移植后胰岛的微血管重建。