研究背景:补体因子H（Complement factor H,CFH）是补体替代途径中起主要的负调控因子。通过失活C3b,CFH减少C3转化酶生成抑制补体替代途径激活。血管新生是指从现有的血管中形成新的血管,与肿瘤,糖尿病以及老年黄斑变性密切相关。CFH是一种血浆蛋白,直接作用于内皮细胞。研究表明CFH具有抑制血管新生作用,但CFH抑制血管新生的作用的分子机制尚不清楚。信号传导与转录激活因子3（Signal transducer and activator of transcription,STAT3）,属于STATs家族,广泛表达于不同类型的细胞中,在调控细胞生长,增殖,凋亡过程中发挥重要作用。血管内皮细胞生长因子受体2（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2,VEGFR2）是血管内皮细胞生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF）受体,调节血管新生。本研究通过探究CFH对人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）增殖和迁移功能的作用,以及CFH对STAT3和VEGFR2调控关系,为血管新生相关疾病的治疗提供靶点和理论支持。研究目的:探究CFH对HUVEC功能的作用及分子机制。研究方法:1.CFH腺病毒转染HepG-2细胞,检测CFH蛋白和mRNA表达水平阴性对照腺病毒和CFH腺病毒分别转染HepG-2细胞48h后,收集HepG-2细胞总蛋白,RNA和培养液上清。Western blot检测HepG-2胞内以及细胞培养液中CFH蛋白表达水平变化,实时荧光定量PCR技术检测HepG-2细胞中CFH在基因表达水平的变化。收集对照腺病毒和CFH腺病毒转染HepG-2细胞的培养液用于以下实验。2.探究CFH条件培养液对HUVEC增殖和迁移功能的影响CFH条件培养液与HUVEC共培养后,使用CCK8和MTT试剂盒检测CFH条件培养液对HUVEC增殖能力的作用。细胞划痕和Transwell实验检测CFH条件培养液对HUVEC迁移能力作用。3.研究CFH条件培养液影响HUVEC迁移的信号通路CFH条件培养液与HUVEC共培养后,提取细胞蛋白,通过Western blot检测AKT和STAT3信号通路相关蛋白表达水平变化。4.验证CFH影响HUVEC迁移的信号通路使用Stattic和STAT3 705Y-D突变质粒分别降低和增加HUVEC STAT3磷酸化水平,再次通过细胞划痕和Transwell实验检测CFH条件培养液对HUVEC迁移能力的作用。研究结果:1.转染CFH腺病毒至HepG-2细胞,48h后,CFH蛋白表达水平和基因表达水平显著增高。收集培养液,通过Western blotting检测培养液中CFH表达情况。转染CFH腺病毒的HepG-2细胞分泌更多的CFH蛋白至培养液。2.MTT和CCK8实验结果显示,CFH条件培养液处理过的HUVEC的吸光度值与对照组相比无明显差异。3.细胞划痕实验结果显示,CFH条件培养液处理过的HUVEC的迁移面积降低。Transwell迁移实验结果显示,CFH条件培养液处理过的HUVEC迁移至下室的细胞数目减少。4.对照条件培养液和CFH条件培养液处理HUVEC,24h后提取蛋白进行Western blot检测。结果显示,对照条件培养液和CFH条件培养液处理的HUVEC中磷酸化AKT蛋白和AKT总蛋白表达水平无明显差异。5.对照条件培养液和CFH条件培养液处理HUVEC,24h后提取蛋白进行Western blot检测。结果显示,CFH条件培养液处理HUVEC中STAT3磷酸化水平降低。6.通过Stattic抑制STAT3磷酸化后,对照条件培养液和CFH条件培养液处理的HUVEC迁移面积和迁移细胞数目无明显差异。7.通过转染STAT3 705Y-D突变质粒升高STAT3磷酸化后,对照条件培养液和CFH条件培养液处理HUVEC迁移面积和迁移细胞数目无明显差异。8.对照条件培养液和CFH条件培养液处理HUVEC,24h后提取蛋白进行Western blot检测。结果显示,CFH条件培养液处理HUVEC中VEGFR2表达水平降低研究结论:1.CFH腺病毒转染HepG-2细胞,上调CFH表达,并促进HepG-2细胞分泌CFH。2.CFH不影响HUVEC增殖能力,但抑制迁移。3.CFH降低HUVEC中STAT3磷酸化水平,不影响AKT信号通路。4.CFH通过降低STAT3磷酸化水平从而抑制HUVEC迁移。5.CFH降低HUVEC中VEGFR2的表达水平。