【摘 要】
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宫颈癌是女性较为常见的恶性肿瘤之一,发病率仅次于乳腺癌,且呈现逐年上升的趋势。随着医疗水平的不断发展,宫颈癌的存活率显著提高,但是其5年存活率仍然低于其它恶性肿瘤。目前临床治疗宫颈癌的常规方法是外科手术切除辅以放化疗,但由于化疗药物的长期使用容易引发宫颈癌患者出现药物耐药,最终导致肿瘤复发和转移,同时也显著影响患者预后。紫杉醇(paclitaxel)是目前临床上治疗肿瘤的常用化疗药物,对多种肿瘤细
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目(81672560):TIMELESS在宫颈癌中异常表达机制及靶向治疗研究; 宿迁市级课题(Z2021108):基于tRF-Glu49/FGL1的宫颈癌调控机制研究;
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宫颈癌是女性较为常见的恶性肿瘤之一,发病率仅次于乳腺癌,且呈现逐年上升的趋势。随着医疗水平的不断发展,宫颈癌的存活率显著提高,但是其5年存活率仍然低于其它恶性肿瘤。目前临床治疗宫颈癌的常规方法是外科手术切除辅以放化疗,但由于化疗药物的长期使用容易引发宫颈癌患者出现药物耐药,最终导致肿瘤复发和转移,同时也显著影响患者预后。紫杉醇(paclitaxel)是目前临床上治疗肿瘤的常用化疗药物,对多种肿瘤细胞具有较好的抑制效果,但是长期使用同样会引发肿瘤的耐药,严重影响临床疗效。因此如何有效抑制肿瘤患者耐药发生或是缓解耐药程度有利于提高肿瘤患者的临床治疗效果,改善患者预后。ARHI是小G蛋白Ras超家族成员,是一类抑癌基因。ARHI编码蛋白在机体多种正常组织(如乳腺、卵巢等)中高表达,而在相应肿瘤组织中表达显著下调,甚至不表达。研究指出ARHI参与调节肿瘤细胞的增殖、迁移、凋亡和自噬等过程。尽管有研究指出宫颈癌组织中ARHI表达水平显著降低与患者临床分期和预后具有相关性,但是目前关于ARHI在宫颈癌发生发展以及耐药中的作用机制尚不清楚。本研究重点以紫杉醇耐药宫颈癌患者组织和紫杉醇耐药HeLa细胞为研究对象,深入分析ARHI在宫颈癌细胞紫杉醇耐药产生中的作用及其与患者相关临床资料之间的相关性,并探讨相应分子机制。本研究首先分析了临床宫颈癌患者肿瘤组织中ARHI的表达,发现ARHI的蛋白和mRNA在紫杉醇敏感的宫颈癌患者(T)肿瘤组织中表达较癌旁正常组织(N)降低,且在紫杉醇耐药患者(T-TR)肿瘤组织中表达较紫杉醇敏感宫颈癌患者(T)肿瘤组织进一步下调。接下来通过临床资料分析发现ARHI表达与患者疾病进展负相关。ARHI基因阳性表达比例在临床Ⅰ、Ⅱ期所占的比例显著高于临床Ⅲ、Ⅳ期患者。高、中分化的宫颈癌组织中,ARHI基因阳性率显著高于低分化组。未发生淋巴结转移的宫颈癌患者肿瘤组织中ARHI基因阳性率显著高于发生淋巴结转移的宫颈癌患者。随访结果显示与紫杉醇非耐药的宫颈癌患者相比,紫杉醇耐药宫颈癌患者在24个月的随访期内复发率、死亡率均显著增高。接下来,本研究在体外细胞水平分析了 ARHI表达对宫颈癌细胞紫杉醇耐药性的影响。通过不同浓度梯度的紫杉醇溶液刺激HeLa细胞,成功构建了紫杉醇耐药的HeLa细胞株(HeLa-TR),此细胞株较HeLa细胞表达出明显的紫杉醇敏感性降低。紫杉醇处理后HeLa-TR细胞凋亡和自噬程度降低,细胞活力则显著提高。Western blot和qRT-PCR结果显示ARHI的蛋白和mRNA表达在HeLa-TR细胞中显著降低,与临床患者组织结果一致。随后,通过细胞转染过表达ARHI质粒及干扰质粒改变HeLa细胞中ARHI表达水平,流式检测发现过表达ARHI可以促进HeLa细胞凋亡,并且能进一步增强紫杉醇诱导的HeLa细胞和HeLa-TR细胞凋亡,干扰ARHI表达作用相反。CCK-8实验和克隆形成实验证明过表达ARHI可增强紫杉醇对HeLa细胞和HeLa-TR 细胞增殖和克隆形成能力的抑制作用,而干扰 ARHI 则发挥促进增殖和克隆形成的作用。此外,过表达ARHI能促进HeLa-TR细胞中自噬的发生,相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ 比值升高,干扰ARHI则显著降低LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ 比值。上述结果表明ARHI在人宫颈癌细胞紫杉醇耐药性产生中发挥重要作用,其表达水平的增高能够显著提高HeLa及HeLa-TR细胞对紫杉醇药物治疗的敏感性。最后,本研究在临床宫颈癌患者肿瘤组织和体外细胞水平分析了宫颈癌细胞紫杉醇耐药分子机制。qRT-PCR结果发现紫杉醇耐药患者(T-TR)肿瘤组织中多耐药基因1(MDR1)mRNA表达水平较紫杉醇敏感患者(T)肿瘤组织和正常癌旁组织(N)升高。Western blot和qRT-PCR结果显示HeLa和HeLa-TR细胞中干扰ARHI表达后显著增强MDR1蛋白和mRNA表达,过表达ARHI则抑制MDR1表达。表明ARHI通过调控MDR1参与到宫颈癌细胞紫杉醇耐药的发生。PI3K/AKT/mTOR信号通路在多种肿瘤发生发展过程中起十分重要的调节作用,参与到肿瘤细胞的增殖、凋亡及自噬等过程。本研究发现在紫杉醇耐药的HeLa-TR细胞中过表达ARHI显著抑制AKT和mTOR的磷酸化水平,干扰ARHI则促进AKT和mTOR的磷酸化。ARHI过表达可通过抑制AKT/mTOR信号通路增强HeLa-TR细胞对紫杉醇敏感性。综上所述,本研究通过临床宫颈癌病人样本分析及体外细胞实验揭示了 ARHI与宫颈癌细胞的疾病进展、紫杉醇耐药性的产生及患者预后的相关性,并阐明ARHI抑制宫颈癌发生发展、逆转紫杉醇耐药的作用机制。本研究为临床治疗宫颈癌、逆转或是预防宫颈癌发生紫杉醇耐药提供新的思路及潜在的干预靶标。
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