研究目的:早发性卵巢功能不全（Premature ovarian insufficiency,POI）是指女性在40岁以前出现卵巢功能减退,临床表现为月经周期异常,同时伴有促性腺激素水平升高（FSH＞25 U/L）和雌激素水平波动性下降。POI的发病率约为3.7%,并呈逐年上升的趋势。POI患者不仅面临不孕及卵巢功能减退伴随的更年期症状,其罹患骨质疏松、心血管疾病、阿尔兹海默症等远期疾病的风险也显著升高,因此,POI的发病影响着女性的身心健康和生活质量。由于目前尚无有效的治疗手段逆转卵巢功能减退,其病因学研究对POI的早期预防、诊断、干预具有重要意义。POI病因高度异质,包含遗传、免疫和医源性因素等。目前研究发现20-25%的POI病因与遗传缺陷相关,但仍有超过半数的POI患者病因不明。随着测序技术的发展,遗传因素在POI病因中的贡献度有待进一步挖掘。mTOR信号通路是调控原始卵泡激活和卵泡发育的重要通路。结节性硬化症复合体（Tuberous sclerosis complex,TSC）由TSC1和TSC2组成,是mTOR的重要负调控因子。在小鼠卵母细胞或前颗粒细胞中条件性敲除Tsc1或Tsc2,会造成mTOR活性异常增高,导致原始卵泡过度激活,加速卵泡池耗竭;但是TSC1和TSC2基因缺陷在POI中的致病性尚不明确。因此,本课题从TSC/mTOR通路出发,利用自有POI-全外显子组测序（Wholeexomesequencing,WES）数据库进行TSC1和TSC2的变异筛选,进而探讨TSC1和TSC2基因突变在POI中的作用和致病机制。研究方法:本研究在自有POI-WES数据库（包含1030例POI患者）中对TSC1和TSC2基因突变进行分析和筛选,后续利用HEK293细胞探究候选位点对mTOR活性的影响以及其作用机制,进一步通过卵巢体外培养实验探究TSC2致病变异对原始卵泡激活的影响。结果:通过在POI-WES数据库中进行TSC1和TSC2基因突变筛选,我们发现了 5个TSC2杂合变异:p.R98Q、p.R901C、p.N919S、p.S1568C 和 p.E1756K。我们对致病性意义不明确（Variant ofuncertiansignificance,VUS）的TSC2变异进行体外功能实验以明确其致病性。在HEK293细胞中过表达野生型及突变型TSC2,发现TSC2p.R98Q的蛋白稳定性降低导致蛋白水平表达量降低,而四个VUS变异（p.R98Q、p.R901C、p.N919S和p.E1756K）导致mTOR下游效应器S6K和4EBP1的磷酸化水平升高,提示它们影响了 TSC2对mTOR活性的负性调控作用。进一步的机制研究发现TSC2变异p.R98Q、p.R901C、p.N919S影响TSC1和TSC2的相互作用,而TSC2变异p.E1756K影响TSC2的GTP酶活性（GTPase activation protein,GAP）。同时,在卵巢体外培养实验中,过表达Tsc2 p.R98Q的卵巢mTOR通路激活并且卵巢中生长卵泡的比例明显增高。结论:本研究利用自有POI-WES数据库,对POI患者进行TSC1和TSC2变异筛选,首次发现5个TSC2的杂合变异。结合体外功能实验发现,TSC2致病变异影响了TSC复合体对mTOR活性的负性调控作用从而使得原始卵泡过度激活。该研究首次提出TSC/mTOR通路介导的原始卵泡过度激活参与了人类POI的发病机制。