研究目的头颈部肿瘤是一类常见的癌症疾病,其发病率正在逐年升高。在头颈部肿瘤的众多病理类型当中,头颈鳞癌（HNSCC）的发病率和死亡率都是最高的。正是由于人类生存环境和家族遗传因素的共同作用,才导致头颈鳞癌的发生发展极其迅速。HPV感染、吸烟和酗酒都是导致该病的危险因素。局部浸润、淋巴结转移和远处转移是造成头颈鳞癌预后不良的主要原因。异源三聚体G蛋白能够在细胞之间传递各种信号,而这种传递过程是受G蛋白偶联受体（GPCRs）调控的。在不同类型的G蛋白中,鸟嘌呤核苷酸结合蛋白α亚基13（GNA13）与肿瘤进展关系最为密切,参与多种肿瘤的发生发展,但GNA13在头颈鳞癌中的表达和对头颈鳞癌生物学行为的影响尚不清楚。活细胞分泌的外泌体能够在人体介质中进行传递,其重要途径之一就是与靶细胞进行融合,并将内部的各种物质在靶细胞内进行释放,从而让靶细胞受到不同程度的激活,最终完成一系列的信号传导过程,成为细胞与细胞之间信息传递的重要媒介。本研究旨在探索GNA13能否通过外泌体影响肿瘤微环境成分的改变,进而促进头颈鳞癌的发生发展,并对其分子机制进行初步探讨。研究方法首先收集GEO数据库中头颈部肿瘤相关的芯片数据,利用R软件筛选差异表达基因GNA13。通过使用癌症基因图集数据库（TCGA）的数据进行分析GNA13在人类常见肿瘤中的表达水平,接着在头颈部肿瘤及正常头颈组织中分析预测GNA13的表达水平。然后收集了临床病人的头颈鳞癌组织及其配对的正常癌旁组织,利用Western blotting检测头颈鳞癌与正常组织中GNA13的表达。在体外培养头颈鳞癌Fadu细胞和人正常鳞状上皮NOK细胞,利用Western blotting和qRT-PCR检测两种细胞中GNA13的表达。利用质粒转染,下调头颈鳞癌细胞中GNA13的表达,分为阴性对照组（si-NC）和下调GNA13组（si-GNA13）,并通过qRT-PCR检测细胞中GNA13的表达。克隆形成实验和CCK-8增殖实验检测下调GNA13对Fadu细胞增殖能力的影响。Transwell实验和细胞划痕实验检测下调GNA13对Fadu细胞迁移和侵袭能力的影响。利用超速离心的方法对处理后的细胞外泌体进行分离和提纯,并在电镜下观察拍摄提取后的外泌体形态,通过粒径分析系统对提取的外泌体进行分析,最后对提纯的外泌体进行Western blotting检测和示踪检测。通过共培养技术将提纯后的外泌体和人正常成纤维细胞进行培养后,使用Western blotting检测MAFs标记蛋白α-SMA和Vimentin的表达。然后通过克隆形成实验和CCK-8增殖实验检测成纤维细胞增殖能力的变化,Transwell实验检测成纤维细胞迁移能力的变化。通过生物信息分析软件预测并筛选出目标miRNA,qRT-PCR检测与外泌体共培养后的成纤维细胞中差异表达的miR-26a-5p。通过Targetscan数据库等在线软件预测miR-26a-5p的下游靶基因,同时利用双荧光素酶报告基因实验和Western blotting进一步验证miR-26a-5p与STRADB的相互作用。在成纤维细胞中过表达STRADB后,克隆形成实验和CCK-8增殖实验检测成纤维细胞增殖能力的变化。Transwell迁移实验检测成纤维细胞迁移能力的变化。Western blotting检测成纤维细胞中MAFs标记蛋白α-SMA和Vimentin的表达。使用过表达STRADB成纤维细胞的条件培养基对Fadu细胞进行培养,通过克隆形成和CCK-8增殖实验检测Fadu细胞增殖能力的变化,通过Transwell实验检测Fadu细胞的迁移和侵袭能力的变化。结果1.GNA13在头颈鳞癌中的表达预测。通过从GEO数据库中收集头颈鳞癌相关的芯片数据,并利用R语言对数据进行筛选分析,得到了包括GNA13在内的10个差异表达基因。基于TCGA生物信息在线数据库预测分析的结果表明,相对于正常组织,头颈肿瘤组织中GNA13的表达水平显著增高。并且GNA13在头颈鳞癌组织中的表达较正常组织显著升高。同时,GNA13与头颈鳞癌分期、分级和淋巴结转移等临床病理特征都具有显著相关性。通过生存分析网站分析GNA13的表达对头颈鳞癌患者预后的影响,生存分析的结果表明,GNA13与头颈鳞癌患者生存时间具有显著相关性。Western blotting实验结果表明,相对于癌旁正常组织,GNA13在头颈鳞癌组织中的蛋白表达水平明显升高。2.下调GNA13抑制头颈鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭。通过小干扰RNA（si-RNA）下调了 Fadu细胞中的内源性GNA13,qRT-PCR实验的结果表明,si-GNA13组GNA13 mRNA的表达较si-NC组下降。克隆形成实验表明,与si-NC组相比,si-GNA13组的细胞增殖能力显著下降。CCK-8实验结果表明,与si-NC组相比,si-GNA13组细胞活力显著降低。Transwell实验结果表明,与si-NC组相比,si-GNA13组的细胞迁移和侵袭能力显著下降。细胞划痕结果表明,si-GNA13组的迁移距离、迁移率均低于si-NC组,si-GNA13组显著抑制Fadu细胞的愈合。3.头颈鳞癌细胞来源的外泌体的分离与鉴定。TEM结果表明,由Fadu细胞分泌的两组外泌体即si-NC Exo组和si-GNA13 Exo组,均具有典型的椭圆形囊泡。纳米粒子追踪分析（NTA）确定其大小分布,结果表明大多数外泌体的直径集中在50-150 nm。通过BCA法检测蛋白实验的结果表明,si-NC Exo组的外泌体蛋白含量为0.31μg/μl,si-GNA13 Exo组的外泌体蛋白含量为0.58μg/μl。Western blotting实验结果表明si-NC Exo组和si-GNA13 Exo组的外泌体能够表达外泌体标记蛋白CD9、CD63 和 CD81。4.GNA13通过外泌体诱导成纤维细胞的转化并促进其增殖和迁移。将外泌体和成纤维细胞在体外共培养24小时。共聚焦显微镜下观察结果表明si-NC Exo组和si-GNA13 Exo组中的外泌体已被有效内化到成纤维细胞中。Western blotting实验结果表明,与si-NC Exo组相比,si-GNA13 Exo组中GNA13的蛋白表达水平显著降低。与si-NC Exo组相比,si-GNA13 Exo组中α-SMA和Vimentin的蛋白表达水平显著降低。当加入外泌体GW4869抑制剂后,与si-NC Exo组相比,si-NC Exo+GW4869组中GNA13的蛋白表达水平显著降低。与si-NC Exo组相比,si-NC Exo+GW4869组中α-SMA和Vimentin的蛋白表达水平显著降低。克隆形成实验表明,与si-NC Exo组相比,si-GNA13 Exo组细胞增殖能力显著降低。当加入外泌体GW4869抑制剂后,与si-NC Exo组相比,si-NC Exo+GW4869组细胞增殖能力显著降低。CCK-8实验表明,与si-NC Exo组相比,si-GNA13 Exo组细胞活力显著降低。当加入外泌体GW4869抑制剂后,与si-NC Exo组相比,si-NC Exo+GW4869组细胞活力显著降低。Transwell实验结果表明,与si-NC Exo组相比,si-GNA13 Exo组细胞迁移能力显著降低。当加入外泌体GW4869抑制剂后,与si-NC Exo组相比,si-NC Exo+GW4869组细胞迁移能力显著降低。5.GNA13通过外泌体调控成纤维细胞中miR-26a-5p的表达。通过三种不同预测miRNA的在线网站数据库预测GNA13可能调控的miRNA。在成纤维细胞中过表达GNA13,Western blotting实验验证GNA13的过表达效率。通过qRT-PCR验证差异表达的miRNA,并选定miR-26a-5p作为目标miRNA。将外泌体与成纤维细胞共培养后,qRT-PCR实验结果表明,与对照组相比,miR-26a-5p在si-NC Exo组中的mRNA表达水平显著下调,而在si-NC Exo+GW4869组中的mRNA表达水平显著上调。6.STRADB是miR-26a-5p的作用靶点。通过三种不同的miRNA靶基因预测网站进行预测分析miR-26a-5p可能调控的下游靶基因。双荧光素酶报告基因实验结果表明,预测靶基因STRADB mRNA 3’-UTR含有高度保守的miR-26a-5p结合位点,同时,此实验结果表明miR-26a-5p减弱了 STRADB-Wt的荧光素酶活性,但对STRADB-Mut的荧光素酶活性没有影响。在成纤维细胞中抑制miR-26a-5p的表达后并用qRT-PCR进行验证。然后通过Western blotting实验验证靶基因STRADB的差异表达。将外泌体与成纤维细胞共培养后,Western blotting实验结果表明,与si-NC Exo组的成纤维细胞相比,si-GNA13 Exo组的成纤维细胞中的STRADB mRNA的表达水平显著降低。当加入外泌体抑制剂GW4869后,与si-NC Exo组的成纤维细胞相比,si-NC Exo+GW4869组的成纤维细胞中的STRADB mRNA的表达水平显著降低。7.过表达STRADB诱导成纤维细胞转化并促进头颈鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭。在成纤维细胞中转染过表达STRADB的质粒,qRT-PCR实验结果表明,与ov-NC组相比,ov-STRADB组中STRADB的mRNA表达水平显著升高。Western blotting结果表明,与ov-NC组相比,ov-STRADB组中的Vimentin和α-SMA蛋白表达量显著升高。CCK-8实验结果表明,相比于ov-NC组,ov-STRADB组的成纤维细胞增殖能力显著升高。Transwell实验的结果表明,与ov-NC组的细胞相比,ov-STRADB组的细胞迁移能力显著升高。用过表达STRADB成纤维细胞的条件培养基培养头颈鳞癌细胞。克隆形成实验和CCK-8实验结果表明,ov-STRADB组中的Fadu细胞（si-NC/si-GNA13）增殖能力和细胞活力较对照组均显著升高。Transwell实验结果表明,ov-STRADB组中的Fadu细胞（si-NC/si-GNA13）迁移和侵袭能力较对照组均显著升高。结论GNA13通过外泌体调控成纤维细胞中miR-26a-5p/STRADB通路,诱导肿瘤微环境中的成纤维细胞转化并促进其增殖和迁移,为肿瘤细胞创造有利于转移的微环境,最终促进头颈鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭。探讨GNA13以及肿瘤来源的外泌体的作用和功能对于研究肿瘤微环境至关重要。本研究为探索GNA13促进头颈鳞癌细胞发生增殖和迁移的分子机制提供了可靠依据,为临床晚期发生肿瘤转移的头颈鳞癌患者的治疗提供了新的方向。