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研究背景和目的:梅毒是一种常见的性传播疾病。一期梅毒患者在生殖器官皮肤感染部位出现的无痛性溃疡（硬下疳）可在几周内自愈,经一段时间的隐匿后再出现继发感染,其具体机制尚不清楚。硬下疳自愈其本质也是一种皮肤伤口的愈合,该过程需要多种细胞的参与。其中就包括成纤维细胞以及微血管内皮细胞,两者均能特异性分泌对伤口修复至关重要的细胞外基质成分—纤连蛋白（Fibronectin,FN）。梅毒螺旋体膜蛋白Tp0136是目前发现的少数几个能与机体纤连蛋白粘附的蛋白之一,其转录水平在感染兔硬下疳皮损愈合阶段升高,提示其在梅毒螺旋体感染过程中可能发挥作用。至今,粘附于细胞表面纤连蛋白的Tp0136蛋白是否通过成纤维细胞和微血管内皮细胞影响皮肤伤口的愈合,尚未有相关研究报道。本研究以人皮肤成纤维细胞和人皮肤微血管内皮细胞（HMEC-1）为研究对象,探讨Tp0136蛋白对人皮肤细胞迁移和血管渗透性改变的影响,开展以下内容研究:（1）探讨Tp0136蛋白对成纤维细胞迁移的影响及机制;（2）探究Tp0136蛋白对微血管内皮屏障渗透性改变的影响及机制。通过以上研究,为今后阐明Tp0136对梅毒硬下疳自愈作用,为下一步深入开展硬下疳自愈机制研究奠定基础。研究方法:1.探讨Tp0136蛋白对成纤维细胞迁移的影响及机制:（1）采用细胞划痕和Transwell试验检测Tp0 136对成纤维细胞迁移影响;（2）采用ELISA和RT-PCR技术检测迁移相关因子表达水平;（3）采用MCP-1（单核细胞趋化蛋白-1）中和抗体、CC趋化因子受体2（CCR2）抑制剂等分析MCP-1对Tp0136蛋白促成纤维细胞迁移过程的影响;（4）采用Western blotting技术和迁移通路抑制剂等分析相关信号通路激活情况;（5）运用TLR4抑制剂和PCR技术分析TLR4在Tp0136蛋白促成纤维细胞迁移过程中的作用。2.探究Tp0136蛋白对微血管内皮屏障渗透性改变的影响及机制:（1）采用微血管内皮HMEC-1细胞构建微血管内皮屏障渗透性检测系统,评估Tp0136蛋白对屏障渗透性的影响;（2）运用RNA测序手段分析Tp0136作用HMEC-1细胞0和6小时后转录组变化,筛选影响微血管内皮屏障渗透性上调的可能因素;（3）采用CCK8法、细胞划痕法、Transwell试验、小管形成试验、出芽试验、ELISA技术、免疫荧光技术、Western blotting技术和细胞因子蛋白芯片技术等分析Tie2-PI3K-AKT-FoxO1-IL-6信号通路对微血管内皮细胞血管生成的影响,及其在上调血管屏障渗透性过程中发挥的作用;（4）通过RNA可变剪切检测技术、PCR技术、RNA-IP技术、基因敲除和过表达技术、Co-IP 技术、Western blotting 技术等分析 Tie2-PI3K-AKT-PTBP1/SRSF1信号通路对微血管内皮细胞形态异常的影响,及其在上调血管屏障渗透性过程中发挥的作用;（5）运用RNA测序手段分析Tp0136作用HMEC-1细胞6和12小时后转录组变化,筛选影响微血管内皮屏障渗透性下调的可能因素;（6）采用Western blotting技术、免疫荧光技术、ELISA技术和PCR技术等分析Tie2-PI3K-AKT-FoxO1/PTBP1/SRSF1信号通路在下调血管屏障渗透性过程中发挥的作用。研究结果:1.有关Tp0136蛋白对成纤维细胞迁移影响影响的实现发现:Tp0136蛋白呈浓度和时间依赖关系促进成纤维细胞迁移（p＜0.05）。在迁移过程中,与迁移相关的细胞因子MCP-1显著升高（p＜0.005）,MCP-1的中和抗体和CCR2的抑制剂（RS102895）均能有效抑制成纤维细胞的迁移（p＜0.005）;Tp0136激活了ERK/JNK/PI3K/NF-κB 信号通路,其抑制剂 U0126（ERK）、SP600125（JNK）、LY294002（PI3K）和BAY11-7082（NF-κb）均能有效抑制MCP-1的分泌和成纤维细胞的迁移（p＜0.05）;而且TLR4的抑制剂TAK242也能有效抑制MCP-1的分泌、成纤维细胞的迁移以及ERK/JNK/PI3K/NF-κB信号通路的活化。2.有关Tp0136蛋白影响微血管内皮屏障渗透性的实验发现:Tp0136蛋白促进微血管内皮屏障渗透性上调,两者呈浓度依赖关系。此外,我们发现10μg/mL Tp0136作用HMEC-1细胞0-6小时内皮屏障渗透性显著性升高（p＜0.01）,在6小时达到最大;随着作用时间的增加,内皮屏障渗透性在6-12小时逐渐下降（p＜0.01）。分析Tp0136蛋白作用于HMEC-1细胞0-6小时转录组的变化,发现上调基因主要集中于细胞分裂和增殖、血管生成以及与可变剪切相关的RNA结合蛋白。我们发现在0-6小时,Tp0136蛋白通过下调Tie2-PI3K-AKT-FoxO1信号通路磷酸化水平促进微血管内皮细胞血管生成,增加内皮屏障渗透性。同时,Tp0136蛋白通过下调Tie2-PI3K-AKT-PTBP1/SRSF1信号通路磷酸化水平激活FN基因可变剪切机制,促进微血管内皮细胞形态异常,增加内皮屏障渗透性。相反地,我们对Tp0136蛋白作用于HMEC-1细胞6-12小时过程中转录组的变化分析发现,在6-12小时调控的信号通路与在0-6小时过程中的基因和信号通路均发生逆转,Tp0136 蛋白上调 Tie2-PI3K-AKT-FoxO1 和Tie2-PI3K-AKT-PTBP1/SRSF1信号通路磷酸化水平,促进微血管内皮细胞形态恢复正常,降低内皮屏障渗透性。研究结论:1.梅毒螺旋体膜蛋白Tp0136通过成纤维细胞膜上的受体TLR4激活ERK/JNK/PI3K/NF-κB信号通路,促进MCP-1的分泌。随后,MCP-1通过其受体CCR2促进细胞迁移。2.梅毒螺旋体膜蛋白Tp0136作用HMEC-1细胞前6小时（0-6小时）,通过下调Tie2-PI3K-AKT信号通路磷酸化水平,调控FoxO1-IL-6和PTBP1/SRSF1信号通路,激活FN基因可变剪切,促进微血管内皮细胞形态异常,介导微血管内皮屏障渗透性升高;相反地,Tp0136作用HMEC-1细胞后6小时（6-12小时）通过上调Tie2-PI3K-AKT信号通路磷酸化水平,调控FoxO1和PTBP1/SRSF1信号通路,促进微血管内皮细胞形态恢复正常,介导微血管内皮屏障渗透性降低。总之,Tp0136蛋白促进成纤维细胞迁移,并影响微血管内皮屏障渗透性,这对促进皮肤愈合是至关重要的。深入探讨Tp0136对梅毒硬下疳自愈作用,将为下一步揭示硬下疳自愈机制的奠定坚实基础。