牙齿在受到外界严重的损伤刺激后,牙髓腔周围的成牙本质细胞死亡,牙髓细胞中的干细胞/祖细胞就会迁移到损伤部位,分化形成成牙本质细胞样细胞,并分泌细胞基质,形成修复性牙本质。目前,牙髓细胞向成牙本质细胞方向分化的机制不是很清楚。很多研究表明,P-catenin在牙齿的发育过程中起至关重要的作用。例如间充质特异性敲除P-catenin使发育中的牙胚停滞于蕾状期。并且有不少研究表明,牙齿发育和牙齿的修复再生存在许多共同调控机制。然而P-catenin在牙齿修复再生过程中的作用不清楚。有研究表明,在间充质干细胞的成骨,成软骨,成脂肪分化过程中,p-catenin起重要作用。因此,P-catenin很可能调控修复性牙本质形成过程中牙髓细胞向成牙本质细胞方向分化。P-catenin能够进入细胞核与多种辅助因子(co-factors)共同启动靶基因的表达。其在不同的生物学过程中通过调控不同的靶基因产生不同的生物学效应。不少研究表明,Runx2是成牙分化和成骨分化中重要的转录因子,它能启动成牙/成骨相关标志基因的转录。从而调控成牙和成骨方向分化。研究表明,Runx2能正向调控DSPP基因的转录,从而促进成牙分化。值得注意的是,Gaur et al.(2005)在小鼠MC3T3细胞系成骨分化的研究中报道β-catenin能够结合Runx2的启动子区并且启动Runx2的表达。因此,我们推测β-catenin在牙髓细胞向成牙本质细胞方向分化中的作用很可能是通过调控Runx2。本研究重点探讨：①β-catenin在大鼠修复性牙本质形成过程中的表达规律。②β-catenin在人牙髓细胞向成牙本质细胞方向分化过程中的作用。③β-catenin是否通过Runx2促进牙髓细胞向成牙本质细胞方向分化。第一部分P-catenin在大鼠修复性牙本质形成过程中的表达规律研究目的：观察P-catenin在修复性牙本质形成过程中的表达分布,初步探讨P-catenin是否参与修复性牙本质形成过程。方法：采用24只Wistar雄性大鼠,对其上颌第一磨牙进行MTA直接盖髓术,分别在0天、7天和14天处死大鼠,分离上颌骨,制作组织切片,HE染色观察修复性牙本质形成过程,免疫组织化学染色分析P-catenin在修复性牙本质形成过程中的表达规律。结果：直接盖髓术后的第7天,修复性牙本质形成于穿髓孔下方,β-catenin强表达于修复性牙本质形成过程中穿髓孔下方的牙髓细胞和成牙本质细胞样细胞,特别是围绕在修复性牙本质周围的牙本质细胞样细胞,β-catenin呈强表达,并且胞核着色较深。第14天,穿髓孔下方形成的修复性牙本质桥将穿髓孔完全封闭。β-catenin的表达方式与术后7天基本一致,强表达在修复性牙本质形成过程中穿髓孔下方的牙髓细胞和成牙本质细胞样细胞,并且胞核着色较深。结论：β-catenin参与修复性牙本质的形成过程,并且可能在牙髓细胞向成牙本质细胞方向分化过程中起作用。第二部分β-catenin在人牙髓细胞向成牙本质细胞方向分化过程中作用的研究目的：观察人牙髓细胞向成牙本质细胞分化过程中β-catenin的表达规律,并且进一步观察β-catenin抑制表达和β-catenin胞内积聚对人牙髓细胞向成牙本质细胞方向分化的影响,探讨β-catenin在人牙髓细胞向成牙本质细胞方向分化过程中的作用。方法：利用β-磷酸甘油钠、地塞米松和抗坏血酸诱导人牙髓细胞向成牙本质细胞方向分化,通过茜素红染色,碱性磷酸酶活性及成牙本质细胞分化相关基因的表达鉴定人牙髓细胞向成牙本质细胞方向分化模型。通过Q-PCR和Western blot检测β-catenin在人牙髓细胞向成牙本质细胞方向分化过程的表达规律。采用慢病毒介导的shRNA抑制β-catenin的表达和LiC1来促进β-catenin的胞内积聚,观察抑制β-catenin的表达和促进β-catenin的胞内积聚后,矿化结节形成的改变及成牙本质细胞分化相关基因表达的改变。结果：在诱导人牙髓细胞向成牙本质细胞方向分化过程中,矿化结节形成,碱性磷酸酶的活性水平逐渐升高,成牙本质细胞分化相关基因DSPP,DMP-1,BSP,OCN的表达显著上调。在人牙髓细胞向成牙本质细胞方向分化过程中,β-catenin的基因及蛋白水平的表达都呈逐渐升高趋势。慢病毒抑制β-catenin的表达后,矿化结节形成减少,成牙本质细胞分化相关基因的表达下降。LiC1促进β-catenin的胞内积聚后,矿化结节形成增加,成牙本质细胞分化相关基因的表达升高。结论：β-catenin能够促进人牙髓细胞向成牙本质细胞方向分化。第三部分P-catenin通过Runx2促进牙髓细胞向成牙本质细胞方向分化目的：探讨β-catenin在牙髓细胞向成牙本质细胞分化过程中的作用机制,确定β-catenin是否通过调控Runx2的表达来调控牙髓细胞向成牙本质细胞方向分化,并确定该机制是否也参与修复性牙本质形成过程中牙髓细胞向成牙本质细胞方向分化过程。方法：通过免疫组化检测Runx2在修复性牙本质形成过程中的表达规律及β-catenin与Runx2在修复性牙本质形成过程中的定位关系。通过Q-PCR和Western blot检测人牙髓细胞向成牙本质细胞方向分化过程中Runx2的动态表达规律。观察抑制β-catenin的表达或者促进β-catenin的胞内积聚后,Runx2的表达情况。通过ChIP实验检测随着牙髓细胞向成牙本质细胞方向分化过程中,β-catenin对Runx2的启动子区结合率的改变。并且检测抑制β-catenin的表达和促进β-catenin的胞内积聚对该结合率的影响。结果：在修复性牙本质形成过程中,Runx2的表达与β-catenin的表达模式基本一致,并且Runx2和β-catenin共表达在修复性牙本质形成过程中牙本质细胞样细胞和穿髓孔下方的牙髓细胞。在人牙髓细胞向成牙本质细胞方向分化过程中,Runx2的表达升高。抑制β-catenin的表达,Runx2的表达受到抑制。相反,β-catenin的胞内积聚能够促进Runx2的表达。免疫共沉淀的结果显示,人牙髓细胞向成牙本质细胞方向分化过程中,β-catenin对Runx2启动子区的结合率增高。抑制β-catenin的表达,β-catenin对Runx2启动子区的结合率降低。相反,β-catenin的胞内积聚增加了β-catenin对Runx2启动子区的结合率。结论：β-catenin能够通过启动Runx2的表达促进牙髓细胞向成牙本质细胞方向分化。该机制可能在修复性牙本质形成过程中起作用。