【摘 要】
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狂犬病是由狂犬病病毒引起的致命性人畜共患病,主要侵袭中枢神经系统,死亡率极高,在表现出临床症状后无有效的治疗手段。疫苗免疫是该病防治最有效的手段,而血清抗体水平的监测则是评价疫苗免疫效果最直接有效的方法。荧光抗体病毒中和（Fluorescent Antibody Virus Neutralization,FAVN）实验作为一种细胞水平的病毒中和实验,是世界动物卫生组织（OIE）推荐的动物血清中狂犬
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狂犬病是由狂犬病病毒引起的致命性人畜共患病,主要侵袭中枢神经系统,死亡率极高,在表现出临床症状后无有效的治疗手段。疫苗免疫是该病防治最有效的手段,而血清抗体水平的监测则是评价疫苗免疫效果最直接有效的方法。荧光抗体病毒中和（Fluorescent Antibody Virus Neutralization,FAVN）实验作为一种细胞水平的病毒中和实验,是世界动物卫生组织（OIE）推荐的动物血清中狂犬病病毒中和抗体的标准检测方法之一。在目前所使用的FAVN方法中不仅需要稳定的荧光素标记特异性单抗,而且不能重复观察。本实验拟通过一种可以表达绿色荧光蛋白的重组狂犬病毒（r Flury-LEP-GFP）建立一种新型的荧光病毒抗体中和（Fluorescent Virus Antibody Neutralization,FVAN）实验方法,在与OIE推荐的FAVN方法比较分析后,利用建立的FVAN方法对兽用狂犬病疫苗的免疫效力进行评估,具体结果如下:首先对狂犬病病毒CVS-11株和带有绿色荧光蛋白标记的重组狂犬病病毒（r Flury-LEP-GFP）进行毒价测定,结果显示,CVS-11的毒价为104.5 TCID50/0.1m L,r Flury-LEP-GFP的毒价为105.5 TCID50/0.1m L。用以上两种病毒分别进行中和实验,结果可见,FVAN方法在荧光显微镜下可以看到清晰的细胞形态,而FAVN法则以点状荧光为主,而且在实际的应用过程中,发现FVAN方法的荧光衰减速度很慢,可以进行重复观察,而FAVN方法的荧光则会快速衰减,必须快速观察记录结果。利用建立的FVAN方法对15份阳性血清的效价进行检测,并与常规的FAVN方法进行相关性比较。结果表明,FVAN的结果与常规FAVN的结果显著相关,表现出了更好的特异性,并且在后续的实验中特异性和重复性良好。以上结果表明本实验构建的FVAN方法可以有效替代传统的FAVN方法,在人与动物的抗体水平监测、确诊、治疗效果鉴定和疫苗评价等方面都有着广泛的应用前景。为评价建立的FVAN方法在实践中的应用效果,本实验在兽用狂犬病灭活疫苗的效力检验上对新建立的FVAN方法进行了初步应用。使用包括参考疫苗在内的8种兽用狂犬病灭活疫苗,分别进行5倍、25倍、125倍和625倍四个浓度的稀释,对32组160只小鼠分别进行免疫,每组5只。在首次免疫后14天和28天采集小鼠的血液,使用FVAN方法检测其血清中和抗体效价。实验结果显示,28天的血清效价在整体上都高于14天。我们同时使用《中华人民共和国兽药典》中规定的狂犬病灭活疫苗小鼠效力检验方法（NIH法）对这8批疫苗的效力进行了检测,利用统计学的方法对二者的结果进行分析发现,利用FVAN方法检测,首免28天25倍稀释组的血清效价,与NIH方法得到的疫苗效价存在显著的相关性,其斜率/差分的R~2值达到了0.8,显示出了二者具有相同的变化趋势。表明该方法可以应用于狂犬病灭活疫苗的效力评价中。综上,本实验建立了FVAN法检测狂犬病病毒中和抗体,对OIE推荐的动物血清中狂犬病病毒中和抗体的标准检测方法进行了优化,并对兽用狂犬病疫苗的免疫效力进行了评估,为其作为一种新方法在兽用狂犬病灭活疫苗效力评价检测中进行应用奠定基础;同时由于该方法不仅可以有效的减少实验动物的用量,由于其不用攻毒的特性,减少了检测所需的时间,更符合动物福利的原则,是狂犬病灭活疫苗效力检测的发展方向。
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