【摘 要】
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单微生物细胞封装技术是指在单个微生物细胞表面构建生物相容性、通透性且具有细胞保护和功能增强的封装壳层,该技术在生物催化、生物传感器、微生物疗法、单细胞分析等领域具有重要应用价值。然而,目前构建的单微生物细胞封装系统还普遍存在封装层理化稳定性能低、结构和厚度难以调控,封装试剂和材料生物相容性低以及封装过程复杂等不足,难以发挥或增强细胞功能。本课题基于溶胶—凝胶法结合细胞表面修饰技术,在单个微生物细胞
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单微生物细胞封装技术是指在单个微生物细胞表面构建生物相容性、通透性且具有细胞保护和功能增强的封装壳层,该技术在生物催化、生物传感器、微生物疗法、单细胞分析等领域具有重要应用价值。然而,目前构建的单微生物细胞封装系统还普遍存在封装层理化稳定性能低、结构和厚度难以调控,封装试剂和材料生物相容性低以及封装过程复杂等不足,难以发挥或增强细胞功能。本课题基于溶胶—凝胶法结合细胞表面修饰技术,在单个微生物细胞表面构建了内层聚多巴胺(PDA)涂层、外层二氧化硅凝胶(Silica)的复合纳米封装层(PDA/Silica)。本课题对封装层的成分和结构进行了详细表征,重点研究了封装系统对细胞的生物学行为影响、保护效果、蛋白分泌以及催化功能影响等,主要内容包括:(1)单微生物细胞封装系统的构建与表征。以真核微生物细胞酵母菌(Yeast)和原核微生物细胞大肠杆菌(E.coli)为模型。首先,利用多巴胺(DOPA)自发氧化聚合形成PDA的特性,通过氢键、迈克尔加成或席夫碱反应在细胞表面形成PDA纳米涂层;然后,采用原硅酸四甲酯(TMOS)和(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷(MPTMS),基于溶胶—凝胶反应并结合PDA涂层的氢键作用在细胞表面形成Silica封装壳层。采用Zeta电位、紫外—可见吸收(UV-vis)光谱、场发射扫描电镜(FE-SEM)、能谱仪(EDX)等,对不同反应条件得到细胞表面PDA涂层和PDA/Silica封装层进行了系统表征和分析,结果表明单微生物细胞封装系统成功构建。(2)封装系统对封装细胞生物学行为影响研究。采用菌落计数对封装细胞存活率进行分析,并采用CCK-8对封装E.coli活性进行定量测定。通过比浊法绘制细胞生长曲线,分析封装细胞周期变化。通过平板培养法测定封装细胞增殖情况。此外,对比分析了不同封装条件下细胞生物学行为的差异性。试验结果表明,PDA涂层操作是影响细胞存活率的关键环节,其中DOPA底物浓度越大,细胞存活率越低。所构建的细胞封装系统,细胞存活率最高为80%~90%,最低为10%~20%。封装细胞在一定时间内处于具有分裂增殖活性的静息状态,细胞分裂发生滞后,且封装层对细胞的包裹越完全,细胞滞后时间越长。(3)封装系统对封装细胞的保护效果和功能影响。以未封装细胞为对照,详细考察了单微生物细胞封装系统抵御外界环境不利因素影响的功能。结果表明,当封装层较为完整且致密时,能够显著增强封装细胞抵御外界强酸、强碱、乙醇、UV辐射、溶菌酶、抗生素、高温等化学或物理刺激的能力。当封装层疏松且封装不完全时,其细胞保护效果不显著。采用带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的E.coli进行蛋白分泌考察,结果表明封装系统不影响E.coli细胞GFP的正常表达,且该封装系统可以充分发挥表面修饰材料PDA的UV吸收特性,为细胞提供显著的抗UV线胁迫功能。此外,采用酿酒酵母(S.cerevisiae)进行细胞催化功能研究,结果表明封装后的S.cerevisiae能够有效进行过氧化氢和蔗糖的催化反应,且相对于未封装细胞,封装细胞可在高温(45℃)下保持较高的催化活性。
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