论文部分内容阅读
[目的]传统观点认为滑膜炎症侵袭到骨,是造成类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)关节破坏的根本原因。但目前常用的抗炎症因子的生物制剂仅对70%的RA患者有效,部分RA病人甚至在滑膜炎症消退后,仍会有新的骨侵蚀出现。表明以滑膜炎症为中心的致病模式不足以解释RA骨侵蚀的发病机制。随着磁共振、超声等影像学技术的进步,近年来越来越多的证据表明RA患者存在的骨髓水肿(bone marrow edema,BME)是最强的预测骨侵蚀的因素。骨髓水肿又被称为“骨炎”(osteitis),表明骨髓内脂肪组织被大量炎性细胞代替。迄今为止,骨髓水肿如何产生及介导骨侵蚀的机制尚不清楚。本研究通过构建胶原诱导关节炎鼠模型(Collagen Induced Arithritis,CIA),采用小鼠7.0T磁共振检查仪检测CIA小鼠发病过程中骨髓水肿变化,分析其与骨髓内微环境、关节滑膜炎症的关系,为探讨骨髓水肿介导RA骨侵蚀的机制及寻找新的治疗靶标奠定基础。[方法]1.CIA小鼠发病过程中骨髓水肿变化采用牛Ⅱ型胶原诱导雄性DBA/1J小鼠关节炎模型,小鼠7.0T磁共振检测CIA小鼠发病不同时期骨髓水肿的发生情况。发病不同时期CIA小鼠膝关节及踝关节脱钙石蜡包埋、切片,通过HE染色分析CIA鼠关节滑膜炎症情况,观察骨髓水肿与关节滑膜炎的关系。2.CIA小鼠发病过程中骨髓微环境变化2.1骨髓内破骨细胞及其分化调控因子RANKL表达的变化(1)破骨细胞变化:流式细胞仪及免疫荧光法分析发病不同时期CIA小鼠骨髓CD11b+Gr-1low+med破骨前体细胞及破骨细胞标记TRAP变化。免疫组织化学TRAP染色观察CIA小鼠不同发病时期中骨髓内破骨细胞数、骨小梁的变化及骨通道形成情况。(2)RANKL变化:通过流式细胞仪和免疫荧光技术分析发病不同时期CIA鼠骨髓细胞表面RANKL表达变化。流式细胞仪分析骨髓中高表达RANKL的细胞来源。(3)CIA小鼠骨髓细胞体外向破骨细胞分化能力分析:取发病不同时期CIA小鼠骨髓细胞,分别以低剂量(25 ng/ml)、中剂量(50 ng/ml)和高剂量(100 ng/ml)RANKL刺激,诱导骨髓细胞向破骨细胞分化,TRAP染色观察其分化能力的差异。2.2 CIA小鼠骨髓内免疫细胞及炎症因子变化流式细胞仪检测CIA小鼠发病不同时期骨髓内T细胞、B细胞、单核细胞、浆细胞数变化。荧光定量PCR分析骨髓细胞中IL-17、TNF-α、CCL3等相关炎症基因表达的改变。3.初步探讨介导骨髓破骨微环境变化的相关基因3.1 RA骨髓基因表达谱分析利用公共基因芯片数据库(GEO)分析活动期RA及骨关节炎(OA)骨髓基因表达谱差异基因。3.2转录因子SOX5在CIA小鼠骨髓细胞中的表达变化运用流式细胞术、免疫荧光及Real-time PCR检测CIA小鼠发病不同时期骨髓细胞SOX5表达情况。[结果]1.CIA小鼠发病过程中骨髓水肿变化CIA小鼠一次免疫后25天左右出现骨髓水肿,此时小鼠无明显关节红肿症状,关节石蜡切片HE染色所示滑膜病理亦未见明显异常,表明CIA骨髓水肿的发生早于临床症状及滑膜炎病理改变的。一次免疫后35天左右小鼠关节炎症状明显,此时为骨髓水肿高峰期,滑膜组织病理可见大量炎性细胞浸润。2.CIA小鼠发病过程中骨髓内微环境变化2.1骨髓内破骨细胞及其分化调控因子RANKL表达的变化(1)免疫荧光及流式细胞术结果显示,造模25天左右,伴随骨髓水肿的出现,骨髓内破骨前体细胞数目显著增高(与无骨髓水肿时比,p=0.035)。此时关节组织TRAP染色阴性,表明骨髓内破骨细胞改变早于关节组织。组织病理学显示,CIA小鼠伴随骨髓水肿的出现,附着于骨内膜的破骨细胞明显增多,以一次免疫后28天及35天最明显。同时,伴随骨髓水肿的出现,小鼠膝关节骨小梁明显减少,造模后35天最明显,较0天约下降14.1%(P=0.0029)。造模28天左右,CIA小鼠软骨表明缺损形成骨通道使骨髓与关节腔相通。(2)造模25天左右,伴随骨髓水肿的出现,骨髓内破骨细胞分化调控因子RANKL的表达明显增加。流式细胞仪进一步分析显示,骨髓内高表达的RANKL主要来源于T细胞及单核细胞。(3)分离来源于CIA鼠发病不同时期骨髓细胞,分别以低剂量(25 ng/ml)、中剂量(50ng/ml)和高剂量(100ng/ml)刺激,诱导骨髓细胞向破骨细胞分化。发现来源于健康对照组小鼠骨髓细胞需高剂量RNAKL刺激后分化形成破骨细胞。而来源于CIA造模28-45天鼠的骨髓细胞(出现骨髓水肿),在低剂量RANKL刺激下即可以向TRAP(+)破骨细胞分化。2.2骨髓内免疫细胞及炎症因子变化CIA小鼠骨髓内T细胞在骨髓水肿早期(25天)明显增加(P=0.0407),并且至45天仍维持在较高水平。单核细胞在造模28天、35及45天均明显高于健康对照小鼠,P值分别为0.0120、0.0338、0.0399。浆细胞在骨髓水肿高峰期(35天)也显著升高(P=0.0175),B细胞未见明显差异。炎症因子IL-17、TNF-α、CCL12在骨髓水肿早期(25天)就明显升高,与健康对照组小鼠相比P值分别为0.0066、0.0061、0.0301,趋化因子CCL3在28天时也显著高于健康对照小鼠(P=0.0337)。CCL2及CCR5的表达未见明显差异。3.介导骨髓破骨微环境变化的相关基因初步探讨3.1 RA骨髓基因表达谱分析骨髓芯片数据显示RA比OA患者有33个基因表达上调1.5倍以上(logFC>1.5),46个基因表达下调1.5倍以上(logFC<-1.5)。差异表达基因涉及细胞周期、细胞代谢、生长因子和转录因子等相关基因。其中,本课题组前期研究发现的调控RANKL基因表达的转录因子SOX5基因表达明显升高,上调约1.676 倍(logFC=1.676),P 值及调整后 P 值分别为 2.02E-0.5 和 0.00449。3.2转录因子SOX5在CIA鼠骨髓细胞中的表达CIA小鼠骨髓细胞中SOX5 mRNA表达高于健康对照鼠约5倍。进一步通过流式及免疫荧光结果显示在CIA小鼠发病过程中骨髓细胞内SOX5表达从骨髓水肿早期(25天)开始明显增加(免疫荧光结果,P=0.0208),并且维持在较高水平至造模45天仍显著高于健康对照小鼠(免疫荧光结果,P<0.0001)。[结论]1.本研究发现在关节炎模型鼠发病过程中,小鼠骨髓水肿、骨髓内破骨细胞、RANKL改变及免疫细胞活化,早于临床症状及滑膜组织病理学改变出现。2.伴随骨髓水肿的出现,CIA小鼠骨髓微环境发生显著变化,形成特殊的利于破骨细胞分化、存活的特殊“破骨微环境”,表现为:骨髓中除T、B、浆细胞和单核细胞免疫细胞活化外,一系列与破骨细胞分化激活(RANKL基因)、迁移(CCL3、CCL12)相关的调控基因和炎症因子(TNFα、IL-17、IL-6)表达显著增加,导致髓腔内破骨前体细胞向成熟破骨细胞分化显著增多。3.伴随骨髓水肿的出现,存在骨髓内“破骨现象”,表现为附着于骨内膜的破骨细胞增多,骨小梁数目明显减少。破骨细胞在某些部位甚至穿透皮质,在髓腔与关节腔之间形成交通的“骨通道”。4.转录因子SOX5在活动期RA及CIA骨髓水肿发生时期骨髓细胞内表达明显升高,可能参与RA骨髓破骨微环境的形成。