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[目的]胃癌(Gastric carcinoma,GC)是最常见的恶性肿瘤之一,严重威胁人类的生命健康。课题组前期采用同位素标记定量蛋白组学技术鉴定了胃粘膜上皮癌变相关差异表达蛋白质丝氨酸蛋白酶1(PRSS1)。本研究旨在探究调控PRSS1表达及其影响胃癌MGC803细胞增殖的分子机制。[方法]1.采用免疫组织化学及Western blot分别检测胃癌组织及胃癌SGC7901、BGC823、MGC803细胞和永生化胃粘膜上皮GES-1细胞中PRSS1蛋白表达情况,分析PRSS1表达的临床病理学意义及与患者预后的关系。2.利用生物信息学方法预测分析与PRSS1靶向结合的miRNA:miRwalk(zmf.umm.uni-heidelberg.de)软件预测与PRSS1结合的miRNA,miRanda(www.microrna.org)软件分析PRSS1-miRNA的热力学稳定性和序列保守性评分,获取与PRSS1靶向结合特异性和稳定性最佳的miRNA,TargetScan(http://www.targetscan.org/,V7.2)软件预测miRNA与PRSS1结合位点及序列。3.通过GEO2R数据库分析miR-146a-5p在胃癌和胃癌旁组织中的表达,实时荧光定量PCR(qRT-PCR))检测miR-146a-5p和PRSS1 mRNA在永生化胃粘膜上皮GES-1细胞和胃癌SGC7901、BGC823、MGC803细胞中的表达水平,分析两者表达的相关性。4.运用Lipofectamine 2000把miR-146a-5p mimic,miR-146a-5p inhibitor及对应的阴性对照miR-146a-5p mimic NC,miR-146a-5p inhibitor NC瞬时转染胃癌MGC803细胞系,CCK8和平皿克隆形成实验观察miR-146a-5p表达变化对胃癌MGC803细胞增殖能力的影响,Western blot和免疫细胞化学检测其对增殖相关蛋白PCNA表达的影响。5.构建PRSS1-WT野生型载体及PRSS1-Mut突变型载体,运用双荧光素酶报告基因系统检测miR-146a-5p与PRSS1 3’-UTR的靶向结合。6.Western blot和qRT-PCR检测miR-146a-5p高表达及低表达对胃癌MGC803细胞中PRSS1蛋白和mRNA表达水平的影响,进一步分析miR-146a-5p对PRSS1表达调控的影响。[结果]1.PRSS1蛋白主要定位于细胞质中,在癌旁胃粘膜、高分化、中分化、低分化胃腺癌及淋巴结转移胃癌组织中的阳性率分别为35.00%(21/60),66.67%(4/6),73.68%(13/19),80.00%(28/35)和88.57%(31/35)。与癌旁胃粘膜组织相比,PRSS1在高分化、中分化、低分化胃腺癌及淋巴结转移胃癌组织中的阳性率均明显增高(P<0.05)。PRSS1在胃癌组织中的表达与患者肿瘤大小、TNM分期及淋巴结转移有关(分别为P=0.007,P=0.001,P=0.004),而与肿瘤患者性别、年龄和肿瘤分化程度无关,并与患者预后差相关(P<0.05)。Western blot分析显示PRSS1在胃癌细胞系中高表达(P<0.001)。2.综合miRwalk、miRanda及TargetScan软件预测分析发现miR-146a-5p与PRSS1 3’UTR区的45-51碱基有结合位点,结合序列是5’-GUUCUC-3’。推断miR-146a-5p是PRSS1的靶miRNA分子。3.GEO2R数据分析miR-146a-5p在胃癌组织中低表达(P<0.05),qRT-PCR证实miR-146a-5p在胃癌SGC7901、BGC823、MGC803细胞中表达水平明显低于胃永生化GES-1细胞(P<0.001),且与PRSS1 mRNA在GES-1细胞和胃癌细胞系中的表达呈负相关。4.CCK8和平皿克隆形成实验结果显示miR-146a-5p mimic组MGC803细胞的增殖能力(P=0.0092)和克隆形成能力(P<0.01)显著减弱,miR-146a-5p inhibitor组细胞的增殖能力(P=0.0343)和克隆形成能力(P<0.01)显著增强,Western blot和免疫细胞化学分析发现miR-146a-5p mimic组MGC803细胞中增殖相关蛋白PCNA表达水平显著下调(分别P<0.05,P=0.0026),miR-146a-5p inhibitor组细胞中PCNA表达水平显著上调(分别P<0.05,P<0.0001)。5.Targetscan软件预测发现miR-146a-5p与PRSS1 3’端UTR区的45-51碱基存在结合位点,结合序列为5’-GUUCUC-3’。通过双荧光素酶报告基因实验证实PRSS1-WT载体与miR-146a-5p共转染入293T细胞后,荧光素酶活性显著降低(P=0.0019),而PRSS1-MUT载体与miR-146a-5p共转染时,荧光素酶活性没有明显变化(P>0.05)。6.qRT-PCR和Western blot实验结果显示,miR-146a-5p mimic显著下调细胞中PRSS1 mRNA(P<0.05)和蛋白的表达(P<0.0001),而miR-146a-5p inhibitor显著上调PRSS1 mRNA(P<0.01)和蛋白的表达(P<0.001)。因此,PRSS1是miR-146a-5p的直接靶基因,miR-146a-5p靶向PRSS1抑制胃癌MGC803细胞的增殖。[结论]1.PRSS1在胃癌组织中高表达,其表达与患者肿瘤大小、TNM分期及淋巴结转移有关。2.miR-146a-5p靶向PRSS1抑制胃癌MGC803细胞的增殖。