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甘油-3-磷酸酰基转移酶GPAT(glycerol-3-phosphateacyltransferases)催化酰基辅酶A连接到甘油-3-磷酸sn-1位上的酰基化反应,被认为是甘油三酯(TAG)生物合成的限速酶。
本研究根据河蟹基因组数据库预测的结果,克隆获得两个中华绒螯蟹GPAT基因(EsGPAT1和EsGPAT2)开放阅读框(ORF)全长。其中EsGPAT1开放阅读框全长为1404bp,编码467个氨基酸,等电点为6.99;EsGPAT2开放阅读框全长为1377bp,编码458个氨基酸,等电点为7.03。对其蛋白结构进行分析发现,两者都隶属于Pfam01553家族,具有该家族的特征:多个跨膜区、四个高度保守基序和对应的功能残基,同时具有该家族重要的活性位点acyltransferase。系统进化树分析表明EsGPAT1和EsGPAT2聚在一起,一致性为51%,且两者与哺乳动物GPAT3和GPAT4基因在进化关系上更为接近。亚细胞定位预测EsGPAT1和EsGPAT2定位于内质网。
通过实时荧光定量PCR和原位杂交技术探明了中华绒螯蟹在不同组织及卵巢不同发育阶段EsGPAT1和EsGPAT2的表达定位情况。结果表明,EsGPAT1和EsGPAT2在肝胰腺、卵巢、胸神经节、脑神经节、胃、肠道、心脏、血淋巴、三角膜、肌肉和鳃11个组织中均有表达。其中EsGPAT1在除了在胸神经节中高表达外,在脂质代谢旺盛的组织中也有较高表达,如肝胰腺和卵巢等组织,EsGPAT2除了高表达于肠道组织外,在神经组织如胸神经节、脑神经节中表达量也很高,其次为肝胰腺和卵巢。卵巢不同发育阶段研究显示,EsGPAT1和EsGPAT2在不同发育阶段具有完全相反的表达模式。无论是在肝胰腺或卵巢中,EsGPAT1在Ⅰ期时表达量最低,随着卵巢不断发育表达量逐渐升高于Ⅳ期时达到最大值;而EsGPAT2则是在Ⅰ期时表达量最高随着卵巢的不断发育表达量逐渐下降。原位杂交结果显示肝胰腺中EsGPAT1和EsGPAT2定位于R细胞核F细胞,而Ⅰ期卵巢中EsGPAT1和EsGPAT2定位于卵原细胞,Ⅲ期卵巢中EsGPAT1和EsGPAT2定位于外源性卵母细胞,Ⅴ期卵巢中EsGPAT1和EsGPAT2定位于卵母细胞。
使用RNAi对EsGPAT1和EsGPAT2进行干扰,检测甘油三酯合成路径上其余基因的表达水平,进一步研究EsGPAT1和EsGPAT2在甘油三酯合成上的功能。结果显示,经过筛选后,5μgdsGPA1framgm1为进一步验证EsGPATs的功能,体外逆转录EsGPAT1和EsGPAT2各合成3条不同的GPAT1和GPAT2dsRNA干扰片段,在26℃的恒温培养箱内,取成熟中华绒螯蟹肝胰腺离体干扰1h、2h、4h、8h。结果EsGPAT1筛选出一条干扰片段在4个时间段内均行使作用,干扰片段的浓度为5μg/mL,EsGPAT2筛选出两条干扰片段持续有效,干扰片段浓度均为2μg/mL.最后为进一步验证EsGPAT的功能,利用荧光定量技术检测。研究发现干扰EsGPAT1能够降低其余基因的表达量,但是EsGPAT2的干扰并不能降低其余基因的表达水平。
本研究根据河蟹基因组数据库预测的结果,克隆获得两个中华绒螯蟹GPAT基因(EsGPAT1和EsGPAT2)开放阅读框(ORF)全长。其中EsGPAT1开放阅读框全长为1404bp,编码467个氨基酸,等电点为6.99;EsGPAT2开放阅读框全长为1377bp,编码458个氨基酸,等电点为7.03。对其蛋白结构进行分析发现,两者都隶属于Pfam01553家族,具有该家族的特征:多个跨膜区、四个高度保守基序和对应的功能残基,同时具有该家族重要的活性位点acyltransferase。系统进化树分析表明EsGPAT1和EsGPAT2聚在一起,一致性为51%,且两者与哺乳动物GPAT3和GPAT4基因在进化关系上更为接近。亚细胞定位预测EsGPAT1和EsGPAT2定位于内质网。
通过实时荧光定量PCR和原位杂交技术探明了中华绒螯蟹在不同组织及卵巢不同发育阶段EsGPAT1和EsGPAT2的表达定位情况。结果表明,EsGPAT1和EsGPAT2在肝胰腺、卵巢、胸神经节、脑神经节、胃、肠道、心脏、血淋巴、三角膜、肌肉和鳃11个组织中均有表达。其中EsGPAT1在除了在胸神经节中高表达外,在脂质代谢旺盛的组织中也有较高表达,如肝胰腺和卵巢等组织,EsGPAT2除了高表达于肠道组织外,在神经组织如胸神经节、脑神经节中表达量也很高,其次为肝胰腺和卵巢。卵巢不同发育阶段研究显示,EsGPAT1和EsGPAT2在不同发育阶段具有完全相反的表达模式。无论是在肝胰腺或卵巢中,EsGPAT1在Ⅰ期时表达量最低,随着卵巢不断发育表达量逐渐升高于Ⅳ期时达到最大值;而EsGPAT2则是在Ⅰ期时表达量最高随着卵巢的不断发育表达量逐渐下降。原位杂交结果显示肝胰腺中EsGPAT1和EsGPAT2定位于R细胞核F细胞,而Ⅰ期卵巢中EsGPAT1和EsGPAT2定位于卵原细胞,Ⅲ期卵巢中EsGPAT1和EsGPAT2定位于外源性卵母细胞,Ⅴ期卵巢中EsGPAT1和EsGPAT2定位于卵母细胞。
使用RNAi对EsGPAT1和EsGPAT2进行干扰,检测甘油三酯合成路径上其余基因的表达水平,进一步研究EsGPAT1和EsGPAT2在甘油三酯合成上的功能。结果显示,经过筛选后,5μgdsGPA1framgm1为进一步验证EsGPATs的功能,体外逆转录EsGPAT1和EsGPAT2各合成3条不同的GPAT1和GPAT2dsRNA干扰片段,在26℃的恒温培养箱内,取成熟中华绒螯蟹肝胰腺离体干扰1h、2h、4h、8h。结果EsGPAT1筛选出一条干扰片段在4个时间段内均行使作用,干扰片段的浓度为5μg/mL,EsGPAT2筛选出两条干扰片段持续有效,干扰片段浓度均为2μg/mL.最后为进一步验证EsGPAT的功能,利用荧光定量技术检测。研究发现干扰EsGPAT1能够降低其余基因的表达量,但是EsGPAT2的干扰并不能降低其余基因的表达水平。