目的:分析NSCLC细胞中PPARγ表达水平与NSCLC患者对培美曲塞化疗疗效的相关性,进一步探索培美曲塞与PPARγ相互作用的分子机制,以求寻找出能有效预测培美曲塞抗肺癌作用疗效的分子靶点或分子标志物。研究方法及结果:1.PPARγ在肺癌细胞系及肺癌组织中的表达水平我们选取7种肺癌细胞系及4例NSCLC患者肺癌及癌旁组织,western-blot检测PPARγ的表达水平,结果发现无论是在细胞水平还是肺组织水平验证,PPARγ的表达水平均存在差异性。选取高表达PPARγ的A549细胞及低表达PPARγ的PC-9细胞,用相同浓度的培美曲塞(10μM)刺激相同的时间(72h)后,CCK8检测细胞增殖情况。结果表明培美曲塞对高表达PPARγ的A549细胞的抑制作用更强。2.癌组织高表达PPARγ的NSCLC患者对培美曲塞化疗的敏感性高于癌组织低表达PPARγ的患者回顾性临床研究中,我们首先收集符合纳入标准的临床NSCLC病例,采用免疫组织化学法对44例NSCLC患者的病理切片进行PPARγ蛋白染色,H-score评分法评估PPARγ蛋白的表达水平,运用SPSS 19.0统计软件建立数据库并进行统计分析。研究结果发现,癌组织高表达PPARγ的患者对培美曲塞化疗的敏感性显著高于癌组织低表达PPARγ的患者,前者的无进展生存时间明显长于后者。3.培美曲塞可同PPARγ配体结合域结合构建PPARγ-LBD的晶体结构及培美曲塞的分子结构,计算培美曲塞与PPARγ配体结构域的完全或部分活性腔结合的相互作用能。研究结果发现,培美曲塞可以和PPARγ配体结构域的部分或完全活性腔结合,并形成稳定的复合体。同时,我们发现培美曲塞作为部分激动剂与PPARγ形成的复合物稳定性更高。4.培美曲塞可通过激动PPARγ,抑制NF-κB的转录活性,从而发挥抑制NSCLC增殖的作用选取正常的肺上皮细胞BEAS-2B及6种NSCLC细胞系细胞,提取组织蛋白,Western-blot检测肺癌细胞系中PPARγ、p-NF-κB、NF-κB表达水平;同时我们选取H1975细胞,用5ng/ml TNF-α刺激30min后,提取细胞蛋白,将细胞蛋白分为Input、IgG、PPARγ、NF-κB组,分别加入相应的抗体,Western-blot检测实验结果。一、观察发现,同种肺癌细胞系相对高表达PPARγ时,P-p65表达相对较低,即相对高表达PPARγ的肺癌细胞系中,NF-κB活性相对较低。二、免疫共沉淀实验中验证出PPARγ可以同NF-κB蛋白发生直接相互作用。选取相对高表达PPARγ的A549肺癌细胞系,用培美曲塞及NF-κB通路激活剂TNF-α刺激A549细胞,实验结果发现:与单用TNF-α细胞组相比,培美曲塞单用或联合TNF-α都可以下调NF-κB的磷酸化水平及c-myc的表达。双荧光素酶报告基因实验中,将PC-9细胞分为生理盐水组、GW9662组(5μg/ml)、培美曲塞组(10μΜ)、培美曲塞组(50μΜ),每组细胞转入等量NF-κB质粒和海肾质粒,12h后按上述分组给予相应刺激,48h后采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测每组NF-κB的转录活性。研究结果发现与未处理对照组相比,用PPARγ拮抗剂GW9662刺激肺癌细胞48h后,NF-κB转录活性增高;用培美曲塞刺激肺癌细胞48h后,NF-κB转录活性降低,呈剂量依赖性。5.动物水平验证PPARγ增敏培美曲塞对肺癌疗效的分子机制采用尿烷诱导Balb/c小鼠肺腺癌动物模型,将15只小鼠平均分为生理盐水组(100μl/kg/W)、尿烷组(1g/kg/W)、尿烷联合培美曲塞组(100mg/kg/W),按以上处理24周后Western-blot检测小鼠肺组织中PPARγ、NF-κB蛋白表达水平。研究结果发现,与未治疗尿烷处理组相比,尿烷联合培美曲塞处理组小鼠肺肿瘤细胞PPARγ表达水平显著增高,同时NF-κB的磷酸化水平受到抑制。结论本研究初步发现:一、PPARγ表达水平与一线行培美曲塞化疗的NSCLC患者的PFS成正相关,对临床上NSCLC患者对培美曲塞的化疗疗效具有潜在的预测作用。二、培美曲塞可作为PPARγ激动剂,通过激活PPARγ抑制NF-κB的活性,发挥抗NSCLC增殖的作用。三、通过动物实验,我们进一步发现培美曲塞可上调PPARγ的表达,抑制NF-κB的磷酸化水平。本课题丰富了培美曲塞治疗肺癌的分子机制,为PPARγ激动剂用于肺癌化疗增敏奠定了理论基础。