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目的探讨褪黑素（Melatonin,MT）通过调控卵巢巨噬细胞的极化在激活内源性卵巢生殖干细胞（Ovarian germinal stem cells,OGSCs）中的作用。研究方法使用氯化钴（CoCl2）刺激诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞缺氧,建立体外巨噬细胞缺氧模型,同时,探索缺氧环境下巨噬细胞Mφ极化状态。进而探索MT对巨噬细胞Mφ缺氧改善和极化状态调节作用;通过卵巢巨噬细胞共培养,探索MT对激活小鼠OGSCs功能的作用。1.筛选CoCl2致RAW264.7巨噬细胞缺氧模型的适宜浓度和作用时间。巨噬细胞RAW264.7孵育CoCl2培养,将RAW264.7巨噬细胞随机分为空白对照（Control）组、50μM CoCl2组、100μM CoCl2组、150μM CoCl2组四组,同步Western blot检测缺氧诱导因子-1α（Hypoxia Inducible Factor-lα,HIF-1α）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的蛋白水平的变化,酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测炎症因子肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor alpha,TNF-α）,一氧化氮（nitric oxide,NO）检测试剂盒测定NO的含量的变化。确定缺氧造模实验CoCl2孵育最佳时间,RAW264.7巨噬细胞孵育CoCl2过程中,通过Western blot检测HIF-1α、核因子κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）和磷酸化NF-κB（Phospho-NF-κB,p-NF-κB）蛋白表达量的变化,确定CoCl2孵育最佳时间。2.MT在调节RAW264.7巨噬细胞炎症因子释放中的作用。MT浓度分别选取为0.01 m M、0.1 m M、1 m M、10 m M和100 m M,与CoCl2致缺氧后的RAW264.7巨噬细胞共培养,Western blot检测RAW264.7巨噬细胞中HIF-1α、NF-κB和p-NF-κB蛋白含量的变化。3.MT通过调节RAW264.7巨噬细胞炎症因子释放在激活卵巢生殖干细胞中的作用。取21天昆明小鼠卵巢和RAW264.7巨噬细胞共培养,分空白组、缺氧组（100μM CoCl2）、褪黑素治疗组（含100μM CoCl2和0.01 m M MT）三组。ELISA检测细胞培养液中免疫因子TNF-α和白细胞介素-10（interleukin-10,IL-10）水平;Western blot检测RAW264.7巨噬细胞HIF-1α、NF-κB和p-NF-κB的蛋白含量,并检测小鼠卵巢中小鼠脉管同源物（mouse vasa homolog,MVH）和八聚体结合蛋白-4（octamer-binding protein-4,OCT-4）的含量变化,同时通过免疫组化的方法观察MVH和OCT-4的分布差异。结果1.筛选了CoCl2致RAW264.7巨噬细胞缺氧模型的适宜浓度和作用时间。50-150μM CoCl2呈剂量依赖性引起巨噬细胞RAW264.7 HIF-1α和VEGF蛋白以及炎症因子TNF-α以及NO含量上升（P＜0.01）,在100μM CoCl2上述指标的变化即具有显著意义。表明,CoCl2导致RAW264.7巨噬细胞缺氧的合适浓度为100μM,故选取100μM CoCl2用于后续实验。100μM CoCl2和RAW264.7巨噬细胞作用后的0、15、30 min和1、2、4、8、12、24 h等不同时间,Western blot检测,在作用8 h左右HIF-1α表达量最高;NF-κB表达没有随着时间的推移发生变化;p-NF-κB在30 min时表达量明显最高,以此确定后续MT加药时,检测HIF-1α的变化量时CoCl2孵育8 h收样,检测p-NF-κB的变化量时CoCl2孵育30 min收样。2.MT能减轻CoCl2致RAW264.7炎症因子释放中的作用。MT与缺氧RAW264.7巨噬细胞共孵育,能够显著降低HIF-1α的表达:Western blot结果显示,0.01 m M MT组与缺氧模型组相比,HIF-1α明显降低（P＜0.01）。同时,MT抑制RAW264.7巨噬细胞缺氧炎症反应:Western blot结果显示,不同浓度MT依据对NF-κB表达不产生影响,却可显著抑制p-NF-κB的表达,0.01m M MT组与缺氧模型组比,p-NF-κB表达量显著下降（P＜0.01）。3.缺氧巨噬细胞与卵巢组织共培养,MT可改善CoCl2诱导的RAW264.7巨噬细胞缺氧。通过MT干预实验发现,治疗组和缺氧组比较,治疗组HIF-1α的蛋白表达量明显减低（P＜0.01）,而且治疗组中p-NF-κB表达量明显下调（P＜0.01）,NF-κB表达量不变。巨噬细胞卵巢共培养,ELISA法检测其中免疫因子TNF-α和IL-10的含量,结果显示:治疗组和缺氧组比较TNF-α一定程度的下降,对于IL-10的分泌,治疗组和缺氧组比较一定程度的上升（P＜0.05）。MT通过抑制RAW264.7巨噬细胞炎症因子释放从而激活卵巢生殖干细胞中。缺氧巨噬细胞与卵巢组织共培养,发现MT对卵巢生殖干细胞相关蛋白MVH、OCT-4的表达有不同程度的影响,Western blot结果显示,缺氧组MVH、OCT-4的蛋白表达均比对照组有显著降低（P＜0.01）,MT治疗组MVH、OCT-4的蛋白表达均比缺氧组有不同程度增高,其中MVH治疗组比缺氧组有显著升高（P＜0.01）。免疫组化染色,显示缺氧组MVH的表达比对照组有所降低（P＜0.01）,缺氧组OCT-4的表达比对照组有所降低（P＜0.05）;MT治疗组MVH、OCT-4的蛋白表达均比缺氧组有不同程度增高（P＜0.01）。结论:CoCl2能够诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞缺氧,MT可改善CoCl2诱导RAW264.7细胞缺氧和炎症反应,其抗炎机制为抑制NF-κB的磷酸化。MT可能通过降低RAW264.7巨噬细胞TNF-α的分泌、促进IL-10的分泌,激活卵巢生殖干细胞的活性。因此,推测MT激活生殖干细胞功能的机制,可能是通过调控驻留卵巢巨噬细胞的极化来实现的。