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目的:在小鼠脊髓撞击伤中探究神经元内自噬流和内质网应激介导的凋亡变化,并进一步阐明二者之间的关系;验证ROS导致神经元自噬流阻滞,加剧SCI后内质网应激介导的凋亡;调控TFE3能修复神经元自噬流,从而抑制SCI后内质网应激介导的凋亡;证明SCI后TFE3的活性受到AMPK-mTOR和AMPK-SKP2-CARM1信号通路的调控。
方法:应用脊髓打击器建立小鼠的撞击伤模型,SCI后1、3、7天取脊髓,设立SCI-Day1,SCI-Day3,SCI-Day7组,以假手术处理的小鼠为对照组。假手术小鼠及SCI小鼠分别予以MnTBAP或相应空载处理,以设立对照+MnTBAP组,SCI+MnTBAP组,对照+Vehicle1组及SCI+Vehicle1组。小鼠予AAV-shTFE3,AVV-Scramble注射,及相应空载处理后,进行SCI处理,以设立SCI+TFE3-shRNA组,SCI+Scramble control组及SCI+Vehicle2组。ATG5-/+小鼠和ATG5+/+小鼠,分别进行SCI及假手术处理,以设立ATG5-/+小鼠+对照组,ATG5+/+小鼠+对照组,ATG5-/+小鼠+SCI组,ATG5+/+小鼠+SCI组。TFE3-wt/wt小鼠和TFE3-KI/wt小鼠分别进行SCI,分为TFE3-wt/wt+SCI组及TFE3-KI/wt+SCI组。在SCI后第1、3、7、14、21及28天进行BMS评分及生存率分析。在SCI后28天行步态印迹检查,在术后第14天行HE,Nissl及Masson染色,并行MAP2,及SYN/NeuN的荧光染色。术后第1、3天进行免疫荧光染色,蛋白印迹检测,LC3turnover检测,qPCR检测来反映自噬流的状态。术后第1、3天进行免疫荧光染色,蛋白印迹检测来评估内质网应激介导的细胞凋亡。术后第1、3、7天行8-OHdG、AOPP和MDA的ELISA检测,免疫荧光染色,蛋白印迹检测,qPCR检测来评估ROS水平及氧化应激状态。术后第1、3、7天行qPCR检测,免疫荧光染色,提取核蛋白行蛋白印迹检测以反映TFE3的活性。术后第3天,蛋白印迹检测及免疫沉淀以反映AMPK-mTOR和AMPK-SKP2-CARM1信号通路情况。最后用低、中、高浓度TBHP处理PC12细胞,以造成神经细胞氧化损伤;再用NAC预处理的PC12进行高浓度TBHP处理。CCK8检测细胞活力,DCFH-DA染色检测ROS水平,进行蛋白印迹检测,免疫荧光染色及Ad-mCherry-GFP-LC3B染色以评估神经细胞自噬流及内质网应激介导的凋亡水平。
结果:脊髓损伤后神经元的自噬流阻断发生在第1天,而内质网应激介导的凋亡在第3天最为明显。对比于ATG5+/+小鼠+SCI组,ATG5-/+小鼠SCI组的神经元自噬流减小,内质网应激介导的凋亡水平上升,且SCI后神经修复延缓。MnTBAP预处理的SCI小鼠,对比于SCI+Vehicle1组小鼠,受损脊髓中ROS减少,溶酶体活性增加,自噬流增强,且内质网应激介导的凋亡水平下降。NAC预处理能抑制TBHP处理后PC12细胞的活性下降,ROS水平升高,自噬流阻滞及内质网应激介导的凋亡增强。TFE3的转录和表达在SCI后的第1天表达显著增加,逐渐减少至第7天;与SCI+Vehicle2组小鼠相比,SCI+TFE3shRNA组小鼠中TFE3表达及入核水平下降,氧化应激增强,神经元自噬流减小,内质网应激介导的凋亡增加且神经修复能力下降。与TFE3-wt/wt+SCI组小鼠相比,TFE3-KI/wt+SCI组小鼠中TFE3表达及入核水平上升,氧化应激减弱,神经元自噬流增强,内质网应激介导的凋亡减弱且神经修复能力增强。SCI后出现AMPK-mTOR和AMPK-SKP2-CARM1信号通路的激活,应用Compound C抑制AMPK-mTOR和AMPK-SKP2-CARM1信号通路后,TFE3的活性显著下降。
结论:小鼠脊髓撞击伤后,神经元自噬流阻滞加重内质网应激介导的细胞凋亡。ROS的过度积累导致脊髓损伤后神经元溶酶体功能紊乱,引发自噬阻滞和内质网应激介导的细胞凋亡。调控TFE3通过增加自噬流和/或ROS清除,以减轻神经元自噬流阻滞,进而抑制内质网应激介导的凋亡,促进SCI后的功能恢复。此外,脊髓损伤后TFE3的激活受AMPK-mTOR和AMPK-SPK2-CARM1信号通路的调控。
方法:应用脊髓打击器建立小鼠的撞击伤模型,SCI后1、3、7天取脊髓,设立SCI-Day1,SCI-Day3,SCI-Day7组,以假手术处理的小鼠为对照组。假手术小鼠及SCI小鼠分别予以MnTBAP或相应空载处理,以设立对照+MnTBAP组,SCI+MnTBAP组,对照+Vehicle1组及SCI+Vehicle1组。小鼠予AAV-shTFE3,AVV-Scramble注射,及相应空载处理后,进行SCI处理,以设立SCI+TFE3-shRNA组,SCI+Scramble control组及SCI+Vehicle2组。ATG5-/+小鼠和ATG5+/+小鼠,分别进行SCI及假手术处理,以设立ATG5-/+小鼠+对照组,ATG5+/+小鼠+对照组,ATG5-/+小鼠+SCI组,ATG5+/+小鼠+SCI组。TFE3-wt/wt小鼠和TFE3-KI/wt小鼠分别进行SCI,分为TFE3-wt/wt+SCI组及TFE3-KI/wt+SCI组。在SCI后第1、3、7、14、21及28天进行BMS评分及生存率分析。在SCI后28天行步态印迹检查,在术后第14天行HE,Nissl及Masson染色,并行MAP2,及SYN/NeuN的荧光染色。术后第1、3天进行免疫荧光染色,蛋白印迹检测,LC3turnover检测,qPCR检测来反映自噬流的状态。术后第1、3天进行免疫荧光染色,蛋白印迹检测来评估内质网应激介导的细胞凋亡。术后第1、3、7天行8-OHdG、AOPP和MDA的ELISA检测,免疫荧光染色,蛋白印迹检测,qPCR检测来评估ROS水平及氧化应激状态。术后第1、3、7天行qPCR检测,免疫荧光染色,提取核蛋白行蛋白印迹检测以反映TFE3的活性。术后第3天,蛋白印迹检测及免疫沉淀以反映AMPK-mTOR和AMPK-SKP2-CARM1信号通路情况。最后用低、中、高浓度TBHP处理PC12细胞,以造成神经细胞氧化损伤;再用NAC预处理的PC12进行高浓度TBHP处理。CCK8检测细胞活力,DCFH-DA染色检测ROS水平,进行蛋白印迹检测,免疫荧光染色及Ad-mCherry-GFP-LC3B染色以评估神经细胞自噬流及内质网应激介导的凋亡水平。
结果:脊髓损伤后神经元的自噬流阻断发生在第1天,而内质网应激介导的凋亡在第3天最为明显。对比于ATG5+/+小鼠+SCI组,ATG5-/+小鼠SCI组的神经元自噬流减小,内质网应激介导的凋亡水平上升,且SCI后神经修复延缓。MnTBAP预处理的SCI小鼠,对比于SCI+Vehicle1组小鼠,受损脊髓中ROS减少,溶酶体活性增加,自噬流增强,且内质网应激介导的凋亡水平下降。NAC预处理能抑制TBHP处理后PC12细胞的活性下降,ROS水平升高,自噬流阻滞及内质网应激介导的凋亡增强。TFE3的转录和表达在SCI后的第1天表达显著增加,逐渐减少至第7天;与SCI+Vehicle2组小鼠相比,SCI+TFE3shRNA组小鼠中TFE3表达及入核水平下降,氧化应激增强,神经元自噬流减小,内质网应激介导的凋亡增加且神经修复能力下降。与TFE3-wt/wt+SCI组小鼠相比,TFE3-KI/wt+SCI组小鼠中TFE3表达及入核水平上升,氧化应激减弱,神经元自噬流增强,内质网应激介导的凋亡减弱且神经修复能力增强。SCI后出现AMPK-mTOR和AMPK-SKP2-CARM1信号通路的激活,应用Compound C抑制AMPK-mTOR和AMPK-SKP2-CARM1信号通路后,TFE3的活性显著下降。
结论:小鼠脊髓撞击伤后,神经元自噬流阻滞加重内质网应激介导的细胞凋亡。ROS的过度积累导致脊髓损伤后神经元溶酶体功能紊乱,引发自噬阻滞和内质网应激介导的细胞凋亡。调控TFE3通过增加自噬流和/或ROS清除,以减轻神经元自噬流阻滞,进而抑制内质网应激介导的凋亡,促进SCI后的功能恢复。此外,脊髓损伤后TFE3的激活受AMPK-mTOR和AMPK-SPK2-CARM1信号通路的调控。