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目的:本课题以龙胆和草乌两种辽宁省道地药材为研究对象,对两种药材进行了本草考证,明确药材历史沿革,追根溯源;采用DNA大分子与指标性成分小分子相结合的双分子鉴定方法对药材品种真伪和品质优劣进行鉴别;结合对药材产地及市场流通情况调查,全面整合,制定龙胆和草乌药材的商品规格等级标准。材料与方法:1材料:龙胆等原植物叶片共37份,药材65份,分别收集自辽宁省、黑龙江省和云南省及国内各大药材市场;草乌等原植物叶片49份,药材20份,分别收集自辽宁省、四川省等地的各大药材市场,经辽宁中医药大学康廷国、许亮教授鉴定。2方法:2.1通过查阅古代本草和现代文献对龙胆和草乌药材进行本草考证。2.2 DNA分子水平提取植物药材及叶片组织中的总DNA,并对其进行ITS2、psb A-trn H序列的PCR扩增,对其扩增产物纯化后进行DNA测序,获得相应的ITS2、psb A-trn H序列信息,利用DNAMAN等软件进行序列拼接并移除低质量及引物部分序列,得到可用于数据分析的序列;利用MEGA 7.0软件对所有序列进行相关数据分析、处理,并构建聚类树(NJ-tree)。2.3次生代谢产物水平利用高效液相色谱法对不同产地不同品种的65批龙胆药材中所含的獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷含量进行测定,并建立不同品种、不同产地的17批药材的HPLC指纹图谱;对20批草乌药材及混伪品中所含新乌头碱、次乌头碱和乌头碱的含量进行测定;并建立不同产地正品以及市场中购买到的混伪品的19批药材的HPLC指纹图谱。2.4通过对药材产地和市场调查,测定药材直径、长度等数据,整理归纳,制作直方图,最后制定龙胆和草乌药材商品规格等级标准。结果:1对龙胆和草乌进行本草考证,可知古代本草中龙胆药材主流为条叶龙胆和龙胆,坚龙胆明确药用品种较晚,且首次在清代吴其浚的《植物名实图考》中以滇龙胆为名与龙胆明确区分,东北和四川地区分别是龙胆和坚(滇)龙胆自古以来的道地产区;草乌在早期本草中记载多与现川乌统称为乌头,区分并不明确,直至公元1228年金朝时期,明确出现川乌和草乌的区分叫法,近现代由于地域原因,叫法上存在一定程度混淆。2龙胆和草乌等实验样本的DNA提取总成功率高,大部分实验样本的ITS2和psb A-trn H序列扩增的琼脂糖凝胶电泳成像图均在相应位置呈现单一且明亮的条带,样本PCR扩增成功率约92%,测序成功率约为91%,对所得序列进行K2P遗传距离计算,比较变异位点,构建NJ系统树,可知此两序列可对龙胆和草乌药材亲缘关系和品种进行高效准确鉴定区分。3对65批龙胆和20批草乌药材进行了HPLC含量测定:龙胆中龙胆苦苷等指标性成分含量高于坚龙胆,样本中约90%均达到药典标准;市场调查中,成都荷花池药材市场的龙胆草这一地方习用药材龙胆苦苷含量达不到药典标准,不推荐市场流通和临床入药;收集到的草乌药材指标性成分约77%达到药典标准,但国内各大药材市场流通的草乌商品混伪品众多,含量达标率仅为约14%;分别建立龙胆和草乌药材的HPLC指纹图谱,龙胆指纹图谱共13个特征峰,草乌药材共8个特征峰,结合相似度数据和含量测定结果以及指纹图谱中各成分峰面积比例,可用于鉴别龙胆和草乌药材优劣真伪及品种。4对龙胆及草乌药材的产地和国内各大药材市场进行了实地考察,文献汇总调研;结合本草考证和双分子鉴定结果,制定龙胆药材分为关龙胆和坚龙胆两种规格,分别含有选货和统货两个等级;草乌的规格等级分为选货和统货。结论:1本草中主流龙胆药材为龙胆和条叶龙但两品种,滇(坚)龙胆这一品种出现较晚,以一明确商品规格形式首次记载于《植物名实图考》;草乌药材在本草中与川乌统称为乌头,至金朝时期加以区分,对两种药材本草考证追根溯源,为商品规格制定奠定基础,提供依据。2初步建立了以ITS2及psb A-trn H序列作为龙胆和草乌药材的DNA条形码鉴定的方法,成功率高,鉴别准确高效,可用于鉴别龙胆和草乌药材的品种和优劣真伪。3对收集到的龙胆和草乌药材进行了含量测定,并且建立了HPLC指纹图谱,龙胆药材中的指标性成分高于坚龙胆药材,符合药典标准,市场上混伪品现象极少,成都药材市场中有龙胆草这一规格,指标性成分含量不达标,不推荐流通使用;草乌药材市场中混伪品众多,指标性成分含量达不到药典标准,正品与伪品成分含量差异明显。4结合本草考证和双分子鉴定结果,从基因和次生代谢产物两个层面全面准确的对药材进行鉴别、分类,通过对各大药材市场及产地的走访,结合相关文献调研整理,在原有基础上制定龙胆的药材商品规格;龙胆分为关龙胆和坚龙胆两种,等级分为统货和选货,草乌规格等级分为统货和选货,草乌作为二类剧毒药材,市场应限制流通,不可随意买卖;制定商品规格指导常用药材龙胆和草乌的市场流通、规范化管理收购使用、旨在提高临床用药疗效。