研究背景和目的1956年英国学者Harmna首次提出自由基衰老学说,该学说认为自由基攻击生命大分子造成组织细胞损伤,是引起机体衰老的根本原因,也是诱发肿瘤等恶性疾病的重要起因。直到1990年美国衰老研究权威Sohal教授指出了自由基衰老学说的种种缺陷,并首先提出了氧化应激的概念。氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时,体内高活性分子如活性氧自由基和活性氮自由基产生过多,氧化程度超出抗氧化物的清除能力,使氧化系统和抗氧化系统失衡,从而导致组织损伤。自由基,化学上也称为“游离基”,是含有一个不成对电子的原子团。它们是机体正常代谢的产物,在体内有很强的氧化反应能力,易对蛋白质、脂质和核酸等产生伤害,从而引起机体的损伤。自由基对人体的损害主要有三个方面:一、使脂质过氧化而破坏细胞膜;二、使血清抗蛋白酶失去活性,引起蛋白质分子聚集和交联;三、破坏核酸的结构,攻击嘌呤与嘧啶基,导致细胞变异的出现和蓄积。然而,自由基同时也是机体内不可缺少的活性物质,它可作为第二信使参与细胞信号转导。事实上,一定程度的氧化作用为机体提供了必需的能量,维持着健康和生命,只有过分强烈的氧化才会危害健康与生命。在正常生理状态下,氧自由基的产生与清除处于动态平衡,当这种平衡被打破,才会有大量的氧自由基蓄积于体内,引起组织的病理损伤,表现在破坏生物膜的完整性及引起细胞结构及其功能发生变化,细胞的病理损伤往往影响体内核酸的代谢,破坏NDA的结构,导致基因突变,引起细胞表达分化异常,进而产生癌变。自由基与肿瘤的研究现状随着生命科学和医学的迅速发展,对许多基本生命现象或疾病机理的探讨已深入到分子水平和细胞水平。目前,自由基医学和生物学已成为一个非常活跃的研究领域,随着自由基致癌理论的发展,人们已充分认识到自由基在诱癌、促癌及抗癌过程中的重要作用。国际癌症研究中心曾提出80%～90%人类肿瘤是由化学物质所引起,而大部分的化学致癌物在其代谢为最终致癌产物的过程中都有产生自由基的中间过程。研究发现肿瘤细胞可产生超氧阴离子,许多肿瘤病人的瘤细胞中氧自由基清除系统存在障碍。过多的自由基引起致癌物质在人体内扩展和连锁反应,攻击DNA造成多种形式的损伤,从而诱发多种疾病发生。虽然人们已认识到自由基参与疾病的发生发展过程,但对其本质及作用机制并非了解透彻。自由基的致、促癌机理和肿瘤发生发展过程中自由基的变化规律以及能否将其作为诊断疾病的一个辅助指标,需进一步探讨。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）又称过氧化物歧化酶,属于金属酶,按照结合金属离子种类不同,该酶有以下三种:含铜与锌超氧化物歧化酶（CuZnSOD）、含锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）和含铁超氧化物歧化酶（Fe-SOD）。三种SOD都催化超氧化物阴离子自由基歧化为过氧化氢与氧气,广泛存在于自然界一切生物体内,是机体内重要的抗氧化物酶之一,能够清除过多的超氧阴离子自由基,保护生物膜及生物大分子结构及其功能,能抑制癌变的作用,被视为是人体内的垃圾清道夫。机体组织中内源性SOD的水平变化可不同程度地反映组织的代谢功能。正常情况下,SOD可特异性地催化氧自由基发生歧化反应,清除体内有毒性作用的自由基,使自由基的产生和清除处于动态平衡之中。任何增强氧化作用和降低抗氧化作用的因素均可破坏这一平衡,导致一系列的病理生理异常。生物体合成SOD的多少受到氧自由基浓度的影响,在氧自由基的诱导下,SOD的生物合成能力增加。SOD局部含量升高是机体中内源性防御系统的反应,故SOD含量的增高间接反映了氧自由基浓度的增高。SOD作为一种重要的抗氧化酶在神经系统疾病以及急性白血病方面已有报道,胡俊等报道了在脑缺血再灌注过程中,一个重要的病理环节就是缺血缺氧通过多种途径使氧自由基增多,使SOD合成障碍,引发生物膜脂质过氧化反应,导致神经功能障碍,自由基增加还可引发Ca²⁺ATP酶活性丧失,Ca²⁺内流,造成微血管内皮细胞和脑实质细胞变性及坏死,同时使Na⁺-K⁺-ATP酶解偶联,引起脑水肿。陈建华等通过对49例脑出血患者和65例脑梗死患者血清SOD活性进行检测,指出了SOD活性参与了脑组织损伤的病理过程,检测SOD活性有助于判断脑出血和脑梗死患者病变程度和病情进展。李秀梅等对42例白血病患者检测了化疗前后血清SOD、谷胱甘肽过氧物酶（glutathione peroxidase GSH-PX）含量,结果发现白血病患者化疗前血清SOD、GSH-PX水平明显低于正常组,化疗后6个月复发者SOD、GSH-PX水平持续异常,未复发者SOD、GSH-PX水平接近正常。但DeviGS等报道了不同类型的急性白血病细胞SOD活性没有明显的差异。中枢神经系统白血病（certral nervous system leukemia,CNSL）的诊断由于大多数化疗药物难以通过血脑屏障,使隐藏在中枢神经系统的白血病细胞不能被有效清除,成为白血病复发的主要原因之一。CNSL可在疾病的各个时期出现,但常发生在治疗后缓解期,急性白血病在起病时较少合并CNSL,但如果没有采用有效的预防措施,不但CNSL发生率高,而且预后差。陈懿建等报道CNSL的发病率约为10～20%,其中急性淋巴细胞白血病并CNSL发生率为26～30%,急性非淋巴细胞白血病并CNSL发生率为5～18%。由于预防CNSL措施的采用,急性髓系白血病的CNS复发率已经下降至5～10%,急性淋巴细胞白血病的CNS复发率降至2～10%。故及时发现和治疗CNSL可以提高患者的生存率和治愈率。目前中枢神经系统白血病的诊断标准如下:1.有中枢神经系统症状和体征（尤其是颅内压增高的症状和体征）。2.有脑脊液的改变:（1）压力增高（>0.02kPa或200mmH₂O）。（2）白细胞数>0.01×10₉/L。（3）涂片见到白血病细胞。（4）蛋白>450mg/L,或潘氏试验阳性。3.排除其他原因造成的中枢神经系统或脑脊液的相似改变。符合条件3加2中的（3）或其他任两项者可诊断CNSL。无症状但有脑脊液改变者可诊断为CNSL。若只有脑脊液压力持续升高,但经抗CNSL治疗后脑脊液压力下降、恢复正常者可诊断CNSL。有症状无脑脊液改变者,如有脑神经、脊髓或神经根受累的症状和体征。可排除其他原因所致,且经抗CNSL治疗后症状有明显改善者可诊断为CNSL。CNSL起病具有隐匿性,早期的临床表现多不典型,甚至无阳性症状和体征。CNSL临床表现主要有下列类型:①颅内压增高;②颅神经损害;③脊髓损害;④脑实质浸润;⑤神经根及周围神经损害。据研究,在光学显微镜下每微升脑脊液（cerebrospinal fluid,CSF）中能看到1个白血病细胞时,CSF中就存在10₅个白血病细胞。此时,CNSL已发展到较严重程度,失去早期治疗的机会。故早期诊断和预防CNSL很重要。目前早期诊断CNSL的指标和方法很多,但临床上尚无特异性和敏感性兼顾的方法。脑脊液细胞学检查对CNSL早期诊断有重要价值,但CSF细胞学检查只有在白血病细胞浸润脑膜时呈阳性,而早期浸润脑实质和周围神经的CSF的改变不明显,甚至阴性,单纯依靠CSF细胞学早期诊断CNSL较困难。因此寻找CNSL新的早期诊断指标对预防和治疗CNSL,提高患者的生存率和治愈率具有重要的临床意义。目前大多数实验研究表明脑肿瘤患者血清中SOD活性增高,是否可通过检测脑脊液中的SOD活性辅助诊断CNSL有待研究。CNSL的治疗现状:目前对CNSL的治疗主要是颅内放疗、鞘内注射化疗药物和全身化疗,这些治疗方法虽然可使患者生存期延长,但由于放疗、化疗副作用大,且多数药物难以通过血脑屏障,而多次腰椎穿刺会增加患者痛苦,患者生活质量下降,同时多次腰椎穿刺也会使穿刺失败率增加。这给我们提出了寻找能通过血脑屏障治疗CNSL的新药的课题。青蒿琥酯研究现状:青蒿琥酯为蒿素素的衍生物,青蒿素作为中药青蒿中的抗疟疾成分,是从菊科植物青蒿中提取的一种含有过氧基团的倍半萜内酯化合物,是我国发现的第一个被国际公认的天然药物,其高效、低毒、脂溶性好、抗疟活性高的药理特性使之成为世界范围的抗疟疾首选药。在青蒿素抗疟作抗疟活性高的药理特性使之成为世界范围的抗疟疾首选药。在青蒿素抗疟作用原理的启发下,国内外不少实验室研究青蒿素用于抗肿瘤的可能性,结果证实了青蒿素及其衍生物有确切的抗肿瘤作用,且青蒿素类药物抗肿瘤具有选择性,能选择性地抑制肿瘤细胞的体外生长,诱导凋亡,抑制增殖,如白血病细胞、纤维肉瘤细胞、卵巢癌细胞、乳腺癌细胞和宫颈癌细胞。其结构新颖、抗肿瘤机制与传统药物不同,与传统药物不存在交叉耐药,这些特性使其具有抗多种肿瘤细胞、毒性低、可能逆转肿瘤细胞的多药耐药等优势,本课题根据青蒿素及其衍生物对肿瘤细胞的杀伤作用和能透过血脑屏障而进入脑组织的药代动力学特性,推测青蒿琥酯有可能可以用于治疗CNSL,成为CNSL治疗的新药。本研究组在前期的实验中验证了青蒿琥酯诱导K562细胞凋亡与铁代谢有关,机制考虑可能为青蒿琥酯与铁反应生成自由基而杀死癌细胞。而青蒿素类药物能够透过血脑屏障,且口服青蒿素类药物比起化疗药物以及放疗毒副作用小、方便、经济,如能证实CNSL患者的发病以及青蒿素类药物诱导肿瘤细胞凋亡与自由基的变化有关,那么,对应用青蒿素类药物治疗CNSL有重要的临床意义。基于以上情况,本研究旨在通过检测抗氧化物之一SOD活性在CNSL患者脑脊液中的变化,以及SOD活性等抗氧化标志物在青蒿琥酯诱导K562细胞凋亡过程中的变化,探讨SOD检测在CNSL诊断中的意义及青蒿琥酯干扰作用机制。研究方法（一）实验材料:1.收集2008年1月到2009年1月南方医院血液科30例中枢神经系统白血病患者脑脊液标本作为实验组,25例无中枢神经系统损害的急性白血病患者脑脊液标本作为对照组。2.人慢粒急变K562细胞株在含10%小牛血清的PRMI-1640培养液中,于37℃、5%CO₂、饱和湿度的培养箱中培养传代,每24～36h传代一次,取对数生长期细胞进行实验。根据本研究组前期的预实验结果,选择青蒿琥酯作用浓度为4×10^-5mol/L、2×10^-4mol/L、1×10^-3mol/L三个浓度组,未加青蒿琥酯组为对照组进行实验。（二）实验方法1.脑脊液常规、生化及细胞涂片分析。2.黄嘌呤氧化酶法检测脑脊液SOD活性。3.Annexin V-PI双染和Hochest 33258检测不同浓度处理组青蒿琥酯诱导的K562细胞凋亡情况。4.黄嘌呤氧化酶法检测不同浓度处理组青蒿琥酯诱导K562细胞凋亡时SOD活性。5.实时荧光定量PCR检测MnSOD、SeGPx mRNA的表达。6.统计学方法采用SPSS13.0统计软件,独立样本t检验（Independent-SamplesT Test）、单项方差分析（One-Way ANOVA）多重比较（LSD）及双变量相关分析,P<0.05为有显著性差异的标准。研究结果1.CNSL组与对照组患者脑脊液中白细胞数量、蛋白含量比较有差异,p值分别为0.000和0.048;两组脑脊液压力、葡萄糖和氯比较均无差异（p>0.05）,由均数水平看,CNSL组脑脊液压力较对照组高,而葡萄糖和氯较对照组低。2.CNSL组与对照组脑脊液SOD活性分别为999.42±461.57,662.17±354.38,两组比较差异有显著性,p值为0.004。3.脑脊液中白细胞数量和蛋白含量分别与SOD活性呈正相关关系,相关系数r_s分别为0.871和0.518,p值分别为0.000和O.003。4.不同年龄组（<45岁、45-59岁、>60岁）脑脊液SOD活性检测结果分别为755.64±345.77,1483.43±266.49,1344.96±367.21。其中以45-59岁年龄组脑脊液SOD活性最高,<45岁年龄组与另外两个高年龄组脑脊液SOD活性比较有显著性差异（p<0.05）,45-59岁年龄组与>60岁组脑脊液SOD活性比较差异无显著性意义（p>0.05）。5.不同浓度(4×10^-5mol/L、2×10^-4mol/L、1×10^-3mol/L)的青蒿琥酯处理6.不同浓度(4×10^-5mol/L、2×10^-4mol/L、1×10^-3mol/L)的青蒿琥酯处理K562细胞48小时,细胞SOD活性检测结果分别为17.64±2.54、47.89±6.38、62.05±1.72。4×10^-5mol/L和2×10^-4mol/L两浓度组与对照组SOD活性比较以及浓度为4×10^-5mol/L、2×10^-4mol/L组与1×10^-3mol/L组SOD活性比较,结果有统计学差异（p<0.05）,浓度为1×10^-3mol/L组与对照组SOD活性比较以及4×10^-5mol/L组与2×10^-4mol/L组SOD活性比较,结果无统计学差异（p>0.05）,各浓度组中,以浓度为4×10^-5mol/L组SOD活性最高。7.实时荧光定量PCR检测MnSOD、SeGPx mRNA结果显示:4×10^-5mol/L、2×10^-4mol/L两浓度组与对照组比较以及浓度为4×10^-5mol/L、2×10^-4mol/L组与1×10^-3mol/L组比较结果有统计学差异（p<0.05）,浓度为10^-3mol/L组与对照组比较以及4×10^-5mol/L组与2×10^-4mol/L组比较,结果无统计学差异（p>0.05）,各浓度组中,以浓度为4×10^-5mol/L组MnSOD和SeGPx mRNA表达最高。初步结论:1.CNSL组患者脑脊液中白细胞数量、蛋白含量明显比对照组高;提示了脑脊液中白细胞数量和蛋白含量的改变对中枢神经系统白血病的诊断有意义;两组脑脊液压力、葡萄糖和氯结果比较无差异。说明了脑脊液压力、葡萄糖和氯对于中枢神经系统白血病的诊断可能非特异。2.CNSL组患者脑脊液的SOD活性明显高于对照组患者,且CNSL组患者脑脊液中白细胞数量和蛋白含量分别与SOD活性呈正相关关系,提示了氧化损伤机制参与了中枢神经系统白血病发病过程,SOD活性的测定能否用于检测疾病的进展,观察疗效,判断预后还有待进一步研究。3.不同年龄组中以45-59岁年龄组脑脊液SOD活性最高,<45岁年龄组SOD活力最低,<45岁年龄组与另两个高年龄组脑脊液SOD活性比较有显著性差异,45-59岁年龄组与>60岁组脑脊液SOD活性比较无差异,提示了脑脊液SOD活性的变化可能与年龄有关。4.不同浓度(4×10^-5mol/L、2×10^-4mol/L、1×10^-3。mol/L)的青蒿琥酯处理K562细胞48小时,细胞总凋亡率呈浓度依赖性,青蒿琥酯作用浓度越高,K562细胞凋亡率越高。随着凋亡率的增加,K562细胞SOD活性以及MnSOD、SeGPx mRNA表达也随着变化。各浓度组中以4×10^-5mol/L组K562细胞SOD活性以及MnSOD、SeGPx mRNA表达最高。随着青蒿琥酯作用浓度的继续增加,凋亡率随之升高,但K562细胞SOD活性以及MnSOD、SeGPx mRNA表达下降,提示了氧化损伤机制参与了青蒿琥酯诱导K562细胞凋亡的过程,但氧化损伤可能不是青蒿琥酯诱导K562细胞凋亡的主要机制。