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背景和目的银屑病是一种常见的免疫介导性皮肤病,以皮肤出现鳞屑、红斑为主要特征,以炎症细胞浸润、角质细胞异常增殖和细胞因子异常分泌为主要病理表现。角质细胞是表皮的主要成分,人永生化角质细胞系HaCaT细胞是研究银屑病体外实验的常用细胞株,角质形成细胞的过度增殖是银屑病病变的关键标志。核因子红细胞2相关因子2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2,NRF2）是细胞对氧化应激适应性反应的中心调节因子。在生理条件下,NRF2与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白（Kelch-like epichlorohydrin associated proteins,Keap1）相连,并被细胞质中的蛋白酶体降解。当细胞受到内外界刺激时,NRF2从Keap1中释放并转移至细胞核中与抗氧化反应元件（Antioxidant response element,ARE）结合,从而激活下游基因的转录。角蛋白（Keratins,KRT）是上皮细胞骨架的主要成分,负责维持角质形成细胞结构的稳定性和完整性。研究表明,NRF2在皮肤癌、鱼鳞病和银屑病等皮肤病的角质形成细胞中高表达,且IFN-γ、IL-17A和IL-22等T细胞来源的细胞因子能通过诱导NRF2的表达来调控角质形成细胞增殖相关的KRT6、KRT16和KRT17的表达。文献资料显示,多种细胞因子与银屑病的发生发展相关,如IL-17、IL-22、IL-23、TNF-α和IFN-γ等,其中IFN-γ起核心调节作用。但这些细胞因子调控角质形成细胞增殖和角蛋白表达的机制及与NRF2和NRF2下游分子表达的相关性,目前均未阐明。本研究通过HaCaT细胞培养,观察了TNF-α、IFN-γ、IL-17A和IL-6等炎症因子对NRF2及下游分子P63表达的影响,同时,对比分析了IFN-γ和NRF2感染对HaCaT细胞增殖和膜分子表达等生物学特性的影响。通过制作银屑病小鼠模型,观察NRF2激动剂和抑制剂对皮肤炎症及外周免疫器官T细胞亚群的影响,旨在进一步阐明NRF2在银屑病皮肤炎症中的作用机制,为改善银屑病临床治疗手段提供新的实验依据。方法1.NRF2在银屑病皮损部位的表达:通过基因表达综合（Gene Expression Omnibus,GEO）数据库中GSE41662和GSE34248数据集分别得到了24和14例银屑病病人皮损部位与非皮损部位m RNA表达水平资料,分析了NRF2在银屑病病人皮损处的表达;在C57BL/6小鼠剃毛背部连续5 d涂抹咪喹莫特（Imiquimod,IMQ）以建立银屑病小鼠模型,收集小鼠背部皮肤,通过q RT-PCR、WB和免疫组化检测小鼠背部皮损处NRF2的表达。2.银屑病相关炎症因子对HaCaT细胞NRF2表达的影响:分别用TNF-α、IFN-γ、IL-17A和IL-6等炎症因子预处理HaCaT细胞,q RT-PCR和WB分别检测NRF2和P63在m RNA和蛋白水平的表达。3.IFN-γ对HaCaT细胞ARE依赖基因、抗原提呈能力及角蛋白表达的影响:用0、10、30、50 ng/m L IFN-γ预处理HaCaT细胞（IFN-γ-HaCaT）24 h后,q RT-PCR检测NQO1、HO-1、GCLC、G6PD、HLA-DRA、HLA-DRB、ICAM-1、PDL-1及KRT1、KRT6和KRT17的m RNA表达,WB检测KRT1、KRT6和KRT17蛋白水平表达。4.过表达NRF2的HaCaT细胞稳转株的构建及鉴定:过表达NRF2慢病毒感染HaCaT细胞（LV-NRF2）,通过荧光显微镜观察、流式细胞术鉴定荧光强度,q RT-PCR和WB分别检测NRF2在m RNA和蛋白水平的表达。5.LV-NRF2对HaCaT细胞ARE依赖基因、抗原提呈能力及角蛋白表达的影响:经嘌呤霉素筛选的慢病毒感染HaCaT细胞稳转株,q RT-PCR检测NQO1、HO-1、GCLC、G6PD、HLA-DRA、HLA-DRB、ICAM-1、PDL-1及KRT1、KRT6和KRT17的表达,WB检测KRT1、KRT6和KRT17蛋白水平表达。6.LV-NRF2和IFN-γ预处理对HaCaT细胞增殖的影响:将两种处理的细胞分别贴壁培养24 h后,通过CCK-8和Ed U检测细胞的增殖情况。7.IFN-γ对LV-NRF2感染的HaCaT细胞NRF2、P63及KRT1、KRT6和KRT17表达的影响:将30 ng/m L IFN-γ刺激LV-NRF2细胞24 h后,通过q RT-PCR检测NRF2、P63及KRT1、KRT6、KRT17的表达。8.NRF2激动剂t BHQ和抑制剂ML385对银屑病小鼠皮肤炎症的影响:将C57BL/6小鼠随机分为以下四组:Control组、IMQ组、t BHQ组和ML385组,其中t BHQ组和ML385组在IMQ涂抹建立银屑病模型的基础上,分别提前1 d腹腔注射50 mg/kg/d t BHQ,30mg/kg/d ML385,连续注射5 d。每日观察各组小鼠皮肤表观变化进行PASI评分,并称重。收集各组小鼠皮肤通过HE染色分析各组小鼠皮肤组织病理学变化;免疫组化分析中性粒细胞的浸润情况;q RT-PCR分析四组小鼠皮损处IFN-γ、IL-17A、IL-17F、TNF-α、IL-22、IL-23、CCL20、IL-6、IL-10等炎症因子表达;收集脾脏细胞,流式细胞术分析CD3+T、CD4+T、CD8+T、Th1、Th17和Treg细胞比例变化。9.NRF2激动剂和抑制剂对银屑病小鼠皮肤角蛋白的影响:收集以上四组小鼠皮损处皮肤组织,分别通过q RT-PCR、免疫组化和WB分析KRT1、KRT6和KRT17在皮损处的表达情况。结果1.NRF2在银屑病皮损部位的表达:通过GSE41662和GSE34248数据集分析NRF2在银屑病病人皮损处的表达明显增加（P＜0.01）;在银屑病小鼠模型中,局部皮损部位NRF2 m RNA（P＜0.01）和蛋白（P＜0.05）水平表达明显增加,且NRF2主要定位于表皮的角质形成细胞中。2.银屑病相关炎症因子对HaCaT细胞NRF2表达的影响:IL-17、IL-6以及TNF-α均不能使NRF2和P63在m RNA水平上的表达发生改变,IFN-γ能明显促进NRF2及P63在m RNA（P＜0.001）和蛋白（P＜0.05）水平表达,且NRF2和P63变化趋势一致,具有一定的时间和浓度依赖性。3.IFN-γ-HaCaT细胞ARE依赖基因、抗原提呈能力及角蛋白表达:不同浓度IFN-γ预处理HaCaT的细胞ARE依赖基因NQO1（P＜0.001）、HO-1（P＜0.05）、GCLC（P＜0.001）、G6PD（P＜0.001）表达上调,HLA-DRA、HLA-DRB、ICAM-1、PDL-1等共刺激分子表达明显上调（P＜0.001）,KRT6和KRT17表达增加,KRT1表达降低,且呈浓度梯度（P＜0.05）。4.过表达NRF2慢病毒感染后,HaCaT细胞NRF2及P63表达:过表达NRF2慢病毒感染HaCaT细胞后,流式细胞术鉴定其转染效率在90%以上,NRF2和P63在m RNA（P＜0.001）和蛋白（P＜0.05）水平表达均显著提高,结果具有统计学差异。5.LV-NRF2对HaCaT细胞ARE依赖基因、抗原提呈能力及角蛋白表达的影响:过表达NRF2后,HaCaT细胞ARE依赖基因NQO1、HO-1、GCLC、G6PD表达上调（P＜0.001）,HLA-DRA、HLA-DRB、ICAM-1、PDL-1等共刺激分子表达明显上调（P＜0.05）,KRT6和KRT17表达增加,KRT1表达降低（P＜0.05）。6.LV-NRF2和IFN-γ预处理对HaCaT细胞增殖的影响:LV-NRF2和IFN-γ这两种处理方式均不影响HaCaT细胞增殖活力（P＞0.05）。7.IFN-γ预处理对LV-NRF2细胞NRF2、P63及KRT1、KRT6和KRT17表达的影响:与LV-NC组相比,IFN-γ刺激使NRF2、P63及KRT6和17的表达明显增加（P＜0.001）,KRT1表达下降;与LV-NRF2组相比,IFN-γ处理使HaCaT细胞NRF2、P63及KRT6和KRT17的表达进一步增强,结果具有统计学意义,KRT1表达有下降趋势,无统计学差异。8.NRF2激动剂和抑制剂对银屑病小鼠皮肤炎症的影响:IMQ组小鼠皮肤出现了红肿,鳞屑和皮肤增厚等典型的银屑病症状,且体重减轻,浸润的中性粒细胞明显增加（P＜0.001）,IFN-γ、IL-17A、TNF-α和IL-22等炎症因子表达明显增加（P＜0.05）;与IMQ组相比,t BHQ组小鼠皮肤增厚明显,中性粒细胞浸润明显减少（P＜0.001）,IFN-γ、IL-17A、TNF-α和IL-22等炎症因子表达皆有下降趋势,无统计学意义,而ML385组小鼠在皮肤厚度、鳞屑上并没有明显变化（P＞0.05）,但红肿加重,炎症因子表达无明显变化（P＞0.05）。9.NRF2激动剂和抑制剂对银屑病小鼠脾脏淋巴细胞的影响:与Control组相比,IMQ组小鼠CD3+T、CD4+T和CD8+T细胞比例明显降低（P＜0.001）,Th1、Th17和Treg细胞比例均有增加（P＜0.05）;与IMQ组相比,t BHQ组小鼠CD3+T、CD4+T和Th17细胞比例有下降趋势,CD8+T、Th1和Treg细胞比例有增加趋势,ML385组小鼠这几种淋巴细胞比例均无明显改变（P＞0.05）。10.NRF2激动剂和抑制剂对银屑病小鼠角蛋白的影响:IMQ组小鼠KRT6和KRT17表达明显增加（P＜0.05）,KRT1表达明显下降（P＜0.05）;与IMQ组相比,t BHQ组小鼠KRT6表达有上升趋势,KRT1和KRT17表达降低,ML385组小鼠三种角蛋白无统计学变化（P＞0.05）。结论IFN-γ可通过上调HaCaT细胞NRF2及其下游靶基因促进银屑病相关角蛋白表达,提示NRF2可能在银屑病皮肤病变的发展过程具有调节功能。