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背景与目的:膀胱癌是男性患者死亡率排名前十的癌症之一。根据最新的数据统计,在2023年,美国将有82,290例新发和16,710例死亡膀胱癌病例。根据肿瘤分期不同,膀胱癌的治疗选择主要包括手术干预、化疗、放疗和免疫疗法等。尽管过去几十年的针对膀胱肿瘤治疗有很大的进展,但膀胱癌患者总体预后仍然较差。因此,明确膀胱癌发病机制,发现新型治疗靶点或药物来改善患者预后是当前急需解决的问题。基因突变和异常生长模式常导致肿瘤细胞内活性氧（Reactive oxygen species,ROS）基础水平高于正常细胞。谷胱甘肽（Glutathione,GSH）作为细胞内重要抗氧化应激物质在保证肿瘤细胞的存活和增殖发挥了重要作用。据报道,膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、头颈部癌、肝癌和肺癌中GSH水平往往比正常组织高,GSH代谢已经被认为参与了多种肿瘤的发生、发展、转移和放化疗耐药。GSH的合成受到多种因素的调节,包括谷氨酸半胱氨酸连接酶（Glutamate cysteine ligase,GCL）的活性和细胞中合成原料的含量。GCL调节亚基（Glutamate cysteine ligase modulating subunit,GCLM）是组成GCL酶的两个亚基之一,有研究表明GCLM促进GSH的合成是肿瘤发生的必要条件,GCLM基因的缺失可以有效抑制肿瘤的恶性转化能力,应用GSH合成抑制剂也可以达到同样的效果。核因子红细胞2相关因子2（Nuclear Factor Erythroid 2-related Factor 2,NRF2）是细胞抗氧化反应的主要调控因子,NRF2可以促进GCLM、GCL催化亚基（Glutamate cysteine ligase catalytic subunit,GCLC）和GSH合成酶（Glutathione synthetase,GSS）的转录来调控GSH的合成帮助细胞抵抗氧化应激。功能富集分析显示GSH代谢和NRF2信号通路与膀胱癌的发展有关。GCLM是铁死亡的调节因子,在膀胱癌中高表达且与不良预后相关,同时可促进膀胱癌细胞的增殖和迁移。因此,靶向NRF2/GCLM信号通路调控的GSH代谢可能是治疗膀胱肿瘤的有效方法。MTX-211是一种EGFR和PI3K激酶双重抑制剂,该药物在膀胱癌中的作用还未知,其与NRF2/GCLM信号通路调控的GSH代谢关系也尚不明确。因此,本研究将通过体内外实验研究MTX-211对膀胱癌细胞的作用并明确对GSH代谢的影响及调控机制。实验方法:1、MTX-211对膀胱癌细胞生物学行为的影响（1）研究MTX-211对膀胱癌细胞、人脐静脉内皮细胞（HUVEC）及永生化的尿路上皮细胞（SV-HUC-1）的毒性作用,采用CCK8实验测定药物对上述细胞活性的影响并测定各细胞的IC50;（2）通过克隆形成试验和EdU增殖实验明确MTX-211在不同浓度下对膀胱癌细胞增殖的影响;（3）采用流式细胞分析技术,检测MTX-211处理后的膀胱癌细胞凋亡和周期比例的变化,并通过western blot实验检测细胞中相关凋亡和细胞周期标志蛋白表达的变化;（4）通过体内裸鼠成瘤实验,明确MTX-211对皮下移植瘤生长的影响并利用HE染色和免疫组化实验观察药物对裸鼠重要脏器的毒副作用和肿瘤Ki-67表达的影响;（5）观察MTX-211对HUVEC细胞在体外血管成形能力及膀胱癌细胞中VEGFA表达的影响;联合顺铂（Cisplatin,CDDP）共同处理膀胱癌细胞,CCK8法测定不同处理组细胞活力并根据细胞抑制率计算联合指数（Combination index,CI）,评估MTX-211与CDDP是否有协同作用。2、MTX-211通过干扰GSH代谢来抑制膀胱癌细胞增殖（1）通过western blot检测MTX-211对细胞内EGFR,pEGFR,PI3K,pPI3K,AKT,pAKT,Erk,pErk蛋白的表达影响;（2）转录组测序分析MTX-211处理后细胞内基因表达变化并通过生物信息学方法分析潜在的信号通路;（3）利用相对应的试剂盒检测药物处理后细胞内GSH水平、GSH/GSSG比值和ROS水平的变化;（4）体外补充GSH后,利用CCK8法观察MTX-211处理后细胞活力的改变以及流式分析检测凋亡和周期阻滞细胞比例的改变情况。3、MTX-211通过促进NRF2泛素化降解来抑制GCLM转录从而抑制GSH合成（1）联合测序数据、GSH代谢通路基因集和NRF2下游靶基因获得MTX-211影响的关键基因GCLM、GSR和IDH1并分析它们在TCGA数据库的膀胱癌中与NRF2的共表达关系;通过RT-qPCR检测细胞内NRF2、GCLM、GSR和IDH1在m RNA水平的表达,以及western blot检测细胞和免疫组化检测不同组别裸鼠肿瘤中NRF2和GCLM表达;（2）联合MG132（蛋白酶体抑制剂）处理细胞后,western blot检测NRF2蛋白表达是否回复并利用放线菌酮（Cycloheximide,CHX）（蛋白合成抑制剂）处理后观察MTX-211对NRF2蛋白降解速率的影响。免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,COIP）实验检测MTX-211对NRF2蛋白泛素水平的影响;（3）western blot和免疫荧光实验检测MTX-211处理后细胞内p62、Keap1、NRF2蛋白表达变化,COIP检测MTX-211对细胞内Keap1与NRF2蛋白结合的影响;（4）用MTX-211处理敲减Keap1表达的膀胱癌细胞系和Keap1突变的肺癌细胞系A549来观察促进的NRF2泛素化降解是否依赖于Keap1及过表达p62或NRF2后药物对p62/Keap1/NRF2信号通路蛋白表达影响;（5）western blot检测MTX-211处理后肿瘤细胞内AKT、pAKT、GSK3β、pGSK3β、β-TrCP蛋白表达并利用免疫荧光实验观察β-TrCP和NRF2的表达,干扰β-TrCP表达后观察MTX-211是否还能抑制NRF2蛋白的表达。结果:1、MTX-211对膀胱癌细胞生物学行为的影响相比于正常上皮细胞,膀胱癌细胞对MTX-211更加敏感且呈浓度和时间依赖性的方式抑制膀胱癌细胞的活力,细胞克隆和EdU实验证明药物抑制了膀胱癌细胞的增殖能力。流式分析结果显示MTX-211能够显著的诱导膀胱癌细胞凋亡和G0/G1期阻滞并升高cleaved-caspase3、cleaved-PARP和p21蛋白的表达。MTX-211还可以抑制体内皮下移植瘤的生长并降低Ki-67的表达且对裸鼠的重要脏器无明显毒副作用。此外,MTX-211还可以抑制HUVEC细胞在体外的血管形成能力并降低肿瘤细胞中VEGFA表达,与CDDP联用具有协同作用。2、MTX-211通过干扰GSH代谢来抑制膀胱癌细胞增殖MTX-211抑制了EGFR及其下游信号通路的激活。通过转录组测序,以q-value＜0.05＆|log2FC|＞1为筛选条件,MTX-211引起了5637细胞中1536个基因上调和694个基因下调。根据KEGG和GSEA分析结果,MTX-211处理后干扰了膀胱癌细胞内GSH代谢过程并影响相关基因的表达。进一步通过相关实验检测显示MTX-211可降低细胞内GSH水平和GSH/GSSG比值并升高细胞内ROS水平。回复实验结果证明补充GSH可以部分回复MTX-211对细胞活力抑制、凋亡诱导和G0/G1期阻滞能力。3、MTX-211通过促进NRF2泛素化降解来抑制GCLM转录从而抑制GSH合成进一步分析测序结果表明MTX-211抑制NRF2下游靶基因的转录。联合测序下调基因、GSH代谢基因和NRF2靶基因取交集后发现三个关键基因:GCLM、GSR和IDH1,在TCGA膀胱癌的数据库中,NRF2表达与上述三个基因成正相关,但后续验证中发现MTX-211处理后只有GCLM转录水平表达在5637和EJ细胞均降低,western blot和裸鼠肿瘤免疫组化显示该药物抑制了NRF2和GCLM蛋白表达。为了进一步证明MTX-211促进了NRF2的泛素化降解,我们发现MG132可以完全回复药物对NRF2表达的抑制作用且联合CHX观察到MTX-211增加了NRF2的降解速率,COIP结果也表明药物处理增加了NRF2蛋白的泛素化水平。从机制上来说,MTX-211通过抑制p62来升高Keap1蛋白表达并促进了Keap1与NRF2蛋白的结合从而促进其泛素化降解,但这一作用并不完全依赖于Keap1的表达。进一步实验结果表明MTX-211通过抑制AKT磷酸化来激活GSK3β从而促进了β-TrCP参与的NRF2蛋白的泛素化降解。结论:1、MTX-211可以有效的在体内外抑制膀胱癌细胞的增殖并且对正常细胞或组织毒性小。2、MTX-211可以通过干扰细胞内GSH代谢来抑制膀胱癌细胞增殖。3、MTX-211通过p62/Keap1和GSK3β/β-TrCP信号通路的共同参与促进NRF2蛋白泛素化降解从而抑制NRF2/GCLM信号通路导致细胞内GSH合成减少。