论文部分内容阅读
研究背景:新生儿缺氧缺血性脑病（Hypoxic-ischemic Encephalopathy,HIE）是围产期窒息引起的脑损伤,是引起儿童严重神经系统后遗症的常见原因之一,也是新生儿死亡的主要原因。缺氧缺血主要损伤大脑皮层,海马以及大脑室下区神经元,而海马及海马环路作为大脑古皮质,在空间记忆力,学习能力以及情感调控中发挥重要作用。未成熟的海马神经元在海马结构发育过程中极易受到外界环境刺激,许多有害刺激例如缺氧以及宫内发育受限等会对海马发育造成严重损伤。E1A激活基因阻遏子（Cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG）具有抑制细胞凋亡、炎症反应和抑制细胞迁移的作用,可以有效抑制心肌肥大、心肌纤维化、动脉粥样硬化等疾病的发生发展进程,在包括肝脏和心脏在内的多个器官缺血再灌注中发挥重要作用。上述发现提示CREG在脑缺血再灌注中可能存在保护作用,为评价CREG在新生儿HIE中的作用提供了研究基础。凋亡是急性期神经细胞坏死及再灌注损伤后的主要病理生理改变,减轻和阻止脑细胞的凋亡是治疗新生儿HIE的有效手段。已有研究表明CREG参与调节细胞凋亡的过程,CREG的过度表达可以抑制血管平滑肌细胞凋亡,CREG沉默则加重凋亡程度。CREG治疗也可以抑制肾脏细胞凋亡,减轻肾纤维化,从而改善高盐饮食诱导的高血压肾病患者的肾功能。上述背景提示CREG有可能在调节新生儿HIE的神经细胞凋亡中起着一定的作用。目的:目前关于CREG在大脑缺血再灌注过程中发挥的作用尚未见报道,本研究的目的旨在观察CREG是否参与调节新生大鼠缺氧缺血性脑损伤并探讨其可能的作用机制,为HIE的治疗提供重要的研究基础。研究方法:1.采用国际公认的新生儿HIE大鼠模型。出生第7天的SD大鼠,雌雄不限,随机分成2组:假手术组和HIE组。假手术组42只,HIE组46只。选取术后3天和7天两个时间点的大鼠取脑组织,取材前对大鼠进行神经行为功能评估。取材后部分脑组织进行TTC染色;部分脑组织浸泡于4%多聚甲醛中,固定后石蜡包埋,待做HE染色及免疫荧光染色;剩余部分取海马组织于-80℃冰箱冻存,采用蛋白免疫印迹（Western-Blot）及实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,q-PCR）检测海马组织的CREG蛋白水平。2.将原代培养传至第三代的海马神经元细胞随机分为正常培养组（Con组）和氧糖剥夺培养组（OGD/R组）。准备进行免疫荧光的细胞,用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline,PBS）冲洗3遍后,加入4%多聚甲醛固定;用于q-PCR的细胞用Trizol总RNA提取液裂解后,收集至无菌的收集管内,于-80℃冰箱保存待用;用做Western-Blot的细胞在弃培养基之后用PBS冲洗细胞3遍,浓度为0.25%胰酶消化贴壁细胞后离心去上清,收集沉淀于无菌收集管内,保存于-80℃冰箱。用Western-Blot及q-PCR检测海马神经元细胞的CREG蛋白水平。3.根据原代海马神经元细胞是否沉默或过表达CREG进行分组,随后进行氧糖剥夺实验,用Western-Blot验证CREG沉默及过表达的效果;MTT试剂盒检测各组海马神经元细胞的活力;TUNEL染色检测海马神经元细胞的凋亡情况;Western-Blot检测各组海马神经元细胞凋亡相关蛋白及凋亡相关通路蛋白的表达情况。4.对过表达CREG组海马神经元细胞根据是否加入PI3K/Akt信号通路特异性抑制剂LY294002进行分组,用Western-Blot及q-PCR方法检测CREG表达是否发生变化;MTT试剂盒检测各组海马神经元细胞的活力;TUNEL染色检测海马神经元细胞的凋亡情况;Western-Blot检测各组海马神经元细胞凋亡相关蛋白及凋亡相关通路蛋白的表达情况。结果:1.缺氧缺血后3天及7天HIE组大鼠翻正反射及悬崖回避实验时间延长（P＜0.05）。TTC染色提示与假手术组相比,HIE组新生大鼠左侧大脑半球出现不同程度梗死现象（P＜0.05）。TUNEL染色提示与假手术组相比,HIE组海马CA1区及CA3区神经元凋亡指数百分比均明显增加。Neu N和CREG双标免疫荧光染色提示HIE组海马CA1和CA3区域的CREG分布减少。Western-Blot检测发现HIE组大鼠动脉结扎侧海马的CREG表达较假手术组下降（P＜0.05）,q-PCR方法检测结果显示HIE组大鼠动脉结扎侧海马CREG的m RNA表达较假手术组减少（P＜0.05）。以上结果证实新生大鼠发生缺氧缺血后海马组织CREG蛋白的表达减少。2.氧糖剥夺后24小时,q-PCR检测结果显示OGD/R组海马神经元CREG的m RNA表达较对照组下降（P＜0.05）,Western-Blot检测结果显示OGD/R组海马神经元CREG蛋白的表达较对照组下降（P＜0.05）,针对神经元标记物Neu N和CREG进行双重免疫荧光染色发现OGD/R组海马神经元的CREG分布减少。以上结果证实氧糖剥夺条件下,海马神经元细胞CREG的表达减少。3.采用Western-Blot技术分别检测对照组与LV-sh NC组及LV-shCREG组、对照组与LV-ex NC组及LV-ex CREG组细胞中CREG的表达水平及差异,结果显示LV-shCREG组原代海马神经元细胞中CREG蛋白的表达水平显著低于对照组及LV-sh NC组（P＜0.05）,说明CREG基因沉默构建成功,而LV-ex CREG组原代海马神经元细胞中CREG蛋白的表达水平显著高于对照组与LV-ex NC组（P＜0.05）,说明CREG基因过表达构建成功。4.MTT法检测结果显示,氧糖剥夺条件下海马神经元的细胞活力明显降低（P＜0.05）。在沉默CREG表达后细胞活力进一步下降,而过表达CREG后神经元活力则显著增强（P＜0.05）。此结果说明在氧糖剥夺条件下,抑制CREG表达可以进一步降低细胞活力且加重细胞损伤,而过表达CREG可以明显改善氧糖剥夺导致的细胞活力降低且减轻细胞损伤。5.TUNEL法检测结果显示氧糖剥夺条件下,沉默CREG表达后凋亡进一步加重,而在过表达CREG后凋亡程度减轻。此结果说明CREG可以改善氧糖剥夺导致的海马神经元凋亡。6.Western-Blot检测结果显示与正常对照组相比,氧糖剥夺会导致海马神经元细胞Bcl2表达水平明显减少,Bax及Cleaved caspase-3蛋白表达水平显著增高,p-Akt水平降低（P＜0.05）,在沉默CREG表达后Bcl2水平进一步减少,Bax及Cleaved caspase-3蛋白表达水平则进一步升高,p-Akt水平进一步降低（P＜0.05）。此结果说明在氧糖剥夺条件下,沉默CREG表达可以增加海马神经元细胞促凋亡蛋白的表达,降低抗凋亡蛋白的表达水平,同时沉默CREG可以降低凋亡通路蛋白p-Akt的表达。与此相反,CREG过表达可以减少海马神经元细胞促凋亡蛋白的表达,提高抗凋亡蛋白的表达水平,同时增加凋亡通路蛋白p-Akt的表达。7.氧糖剥夺条件下,LY294002对CREG过表达的原代海马神经元细胞中CREG蛋白的表达没有影响;MTT检测提示LY294002可以降低CREG过表达后海马神经元的细胞活力且加重细胞损伤;TUNEL检测提示使用LY294002后,CREG过表达对海马神经元的凋亡抑制作用被逆转;利用Western-Blot方法检测结果显示OGD/R+LV-ex CREG+LY294002组海马神经元中Bcl2表达水平明显减少,Bax蛋白表达水平升高,p-Akt水平降低（P＜0.05）。这些结果说明p-Akt是CREG的下游信号分子,在氧糖剥夺条件下,LY294002可以增加CREG过表达的原代海马神经元促凋亡蛋白的表达,减少抗凋亡蛋白的表达水平,同时减少凋亡通路蛋白p-Akt的表达。结论:1.CREG在HIE动物模型及OGD/R海马神经元细胞模型中表达水平明显降低,提示CREG在HIE的发生发展中可能发挥抑制作用。2.通过在细胞水平沉默及过表达CREG,发现CREG在氧糖剥夺条件下能够提高海马神经元细胞的活力并抑制海马神经元细胞的凋亡,进一步证实了CREG在HIE发生发展中的抑制作用,并揭示CREG主要通过抑制细胞凋亡和增加细胞活力来实现在缺血再灌注脑损伤中的保护作用。3.通过在细胞水平使用PI3K/Akt信号通路特异性抑制剂LY294002,证实CREG可以通过激活PI3K/Akt信号转导通路,增加Akt磷酸化水平,提高Bcl2表达,进而抑制海马神经元细胞凋亡。4.本研究的实验结果表明,CREG是脑缺血再灌注的负调控因子,其作用机制是通过激活PI3K/Akt信号通路进而抑制海马神经元细胞凋亡。因此,CREG有望成为临床上治疗脑缺血再灌注损伤的重要靶点。