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[目 的]创建大鼠骨质疏松症模型,采用本实验室创建的方法制备大鼠高活性脐带间充质干细胞（Highly Active Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,HA-UCMSC）,对骨质疏松症模型大鼠进行HA-UCMSC治疗,明确HA-UCMSC治疗骨质疏松症的疗效,阐明其细胞与分子机制,为临床HA-UCMSC治疗骨质疏松症提供技术参考和理论依据。[方法]1.大鼠骨质疏松症动物模型的建立:以8月龄雄性SD大鼠为研究对象,采用地塞米松磷酸钠注射液诱导法,按照0.25mg/100g/次的剂量,每周2次,间隔3天,连续6周,于大腿外侧肌肉注入地塞米松磷酸钠注射液,同步设置注射等量生理盐水的正常大鼠作为对照。于末次注射后2周时,对诱导组和正常大鼠使用微型CT（Micro-CT）断层扫描并分析左侧胫骨骨密度（bone mineral density,BMD）模型评价,以出现骨密度降低9%的大鼠为进一步研究的模型。2.制备HA-UCMSC的方法:采用本实验室新创建的HA-UCMSC制备方法和传统组织贴壁法分别制备HA-UCMSC和UCMSC。无菌采集19d SD胎鼠脐带,去除被膜及血液等,剪成1mm3大小,将组织块接种到75cm2培养瓶中,分别加入3ml不同培养基,轻轻摇晃混匀后,置于培养箱中进行贴壁培养,待组织块贴壁后加入2ml培养基,待间充质干细胞呈放射状大量长出后,收集间充质干细胞进行传代培养。对P4代细胞进行鉴定,在倒置显微镜下观察其形态,采用流式细胞术分析细胞周期和免疫表型,采用定向诱导培养法分析鉴定其分化潜能。3.移植方法及疗效评价:将前期制备获得的骨质疏松症模型大鼠分为模型对照组（n=7）、UCMSC治疗组（n=8）和HA-UCMSC治疗组（n=8）,同时设健康对照组（n=10）。对UCMSC治疗组和HA-UCMSC治疗组分别进行两种UCMSC治疗。方法为:于UCMSC治疗组和HA-UCMSC治疗组大鼠尾静脉分别注射两种UCMSC 2.29X 106个/kg/次,健康对照组、模型对照组同步注射等量生理盐水。于治疗后4周时对大鼠进行BMD检测后处死大鼠,取右胫骨进行骨组织切片和HE染色,在光学显微镜下观察骨组织结构,取右股骨的骨髓分离培养BMMSC并进行成骨分化能力分析,于治疗后1周采集外周血并分离血清,测定血清骨骨形成与骨吸收标志物CTX、RANKL、PINP和OPG的含量。通过对比分析,综合判定UCMSC治疗骨质疏松症的疗效。4.HA-UCMSC治疗大鼠骨质疏松症的机制分析:（1）采集健康大鼠股骨骨髓,分离培养获得P4代骨髓间充质干细胞,与10-6mol/L的地塞米松共培养72h,获得体外地塞米松诱导的BMMSC,采用qPCR法检测诱导的BMMSC和未诱导BMMSC中的成骨相关因子ALP、RUNX2的表达水平,分析地塞米松对BMMSC成骨活性的抑制作用。将BMMSC以3×103个/cm2的接种密度接种1.5ml细胞悬液到transwell下室中,地塞米松诱导72h,transwe ll上室中分别接种6×103个/cm2两种UCMSC,进行共培养48h,对其进行成脂、成骨分化能力分析。（2）通过western blot分析骨组织WNT、β-catenin和RUNX2的表达水平,揭示UCMSC与HA-UCMSC治疗对成骨分化信号通路WNT/β-catenin的干预作用及差异。（3）采集外周血,采用流式细胞术进行Treg细胞的比例分析,提取骨组织蛋白进行western blot分析IFN-γ和IL-17的表达水平,分析两种间充质干细胞对免疫功能的调节作用。[结 果]1.大鼠骨质疏松症模型的评价:采用地塞米松诱导6周,继续饲养2周,检测BMD发现:正常对照组BMD为605.28±31.17mg/cm3,诱导组BMD为496.73±33.91 mg/cm3,两组比较P＜0.0001,结果表明成功建成骨质疏松症模型。按此方法制备获得23只大鼠骨质疏松症模型,为后续治疗实验提供了研究对象。2.两种UCMSC的鉴定:对P4代两种UCMSC进行形态、结构、细胞周期、表型特征及分化潜能分析,结果如下:UCMSC、HA-UCMSC均呈漩涡状生长,细胞形态呈梭形;HA-UCMSC比UCMSC体积小、核占比大;G0/G1期的细胞比例分别为65.30%和74.75%;均高表达CD73、CD90和CD105,不表达或低表达CD34和CD45,但HA-UCMSC表达sox2、oct4的水平比UCMSC相对较高;均在体外诱导条件下可分化为脂肪细胞、成骨细胞和成软骨细胞,但HA-UCMSC的分化程度更高（P＜0.05）。结果表明,HA-UCMSC是一种比UCMSC活性更高的新型UCMSC。3.HA-UCMSC和UCMSC移植治疗骨质疏松症疗效差异:（1）健康对照组的BMD为 610.33±24.99mg/cm3,模型对照组的 BMD 为 472.61±24.12 mg/cm3,UCMSC治疗组的 BMD 为 554.85±15.95 mg/cm3,HA-UCMSC 治疗组的 BMD 为 577.56±17.93 mg/cm3,UCMSC治疗组、HA-UCMSC治疗组分别与模型对照组相比BMD均显著升高（P＜0.0001）,但仍低于健康对照组（P＜0.05）,HA-UCMSC治疗组的BMD高于UCMSC 治疗组（P＜0.05）。（2）骨组织结构变化:与模型对照组比较,两个治疗组的骨组织结构均显示骨小梁面积显著升高（P＜0.05）,HA-UCMSC治疗组比UCMSC治疗组的骨小梁面积和骨小梁面积百分比升高,但骨小梁面积百分比升高差异显著（P＜0.05）,骨小梁面积无统计学意义;两个治疗组骨小梁数目和骨小梁周长均高于模型对照组（P＜0.05）,HA-UCMSC治疗组高于UCMSC治疗组（P＜0.05）,成骨细胞形态为柱形或立方状,扁平上皮样的骨被覆细胞减少。HA-UCMSC治疗组与健康对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。结果表明,两组UCMSC治疗后均使骨质疏松症大鼠的骨结构明显改善,使骨小梁增粗、数目增多,HA-UCMSC治疗组的结构优于UCMSC治疗组。（3）对治疗后4周的各组股骨的骨髓的P4代BMMSC进行成骨分化诱导发现,骨质疏松症大鼠的BMMSC成骨分化能力显著降低,经UCMSC治疗后成骨能力比模型对照组显著提高。主要表现为钙质结节增多,HA-UCMSC治疗组显著多于UCMSC治疗组（P＜0.05）,但HA-UCMSC治疗组与健康对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。该结果说明HA-UCMSC比UCMSC治疗对逆转骨质疏松症大鼠的BMMSC成骨分化作用更强。（4）治疗后1周,外周血清中与骨吸收相关的RANKL含量显著下降（P＜0.05）,与骨形成相关的PINP含量显著升高（P＜0.05）,CTX含量与OPG含量有一定变化,但无统计学意义。HA-UCMSC治疗组的OPG/RANKL高于UCMSC治疗组（P＜0.05）。该结果说明两种UCMSC治疗均具有抑制骨吸收因子表达和提高骨形成因子表达的作用,HA-UCMSC的作用优于UCMSC。4.HA-UCMSC治疗大鼠骨质疏松症的机制:（1）对健康大鼠的P4代BMMSC与地塞米松共培养后,成骨相关因子ALP、RUNX2的表达水平降低（P＜0.05）,分别与两种UCMSC共培养48h后,其成骨和成脂分化能力显著提高（P＜0.05）,表现为能形成更多的钙结节和脂滴,HA-UCMSC治疗组优于UCMSC治疗组。该结果提示,地塞米松诱导的大鼠骨质疏松症导致BMMSC的成骨分化能力降低,HA-UCMSC治疗可使其成骨分化能力恢复至正常水平。（2）细胞移植治疗4周,治疗组WNT、β-catenin和runx2比模型对照组表达水平显著提高（P＜0.05）,HA-UCMSC治疗组高于UCMSC治疗组（P＜0.05）。该结果提示,HA-UCMSC治疗通过促进WNT、β-catenin和runx2的表达,激活了WNT/β-catenin信号通路,进而促进BMMSC向成骨细胞分化。（3）外周血Treg细胞和骨组织免疫调节因子分析结果显示:UCMSC治疗后4周,健康对照组、模型对照组、UCMSC治疗组和HA-UCMSC治疗组外周血的中Treg细胞比例分别为2.37%、0.96%、1.27%和2.09%;与模型对照组相比,治疗组骨组织IFN-γ表达水平降低,IL-17表达水平降低显著（P＜0.05）。该结果表明,HA-UCMSC可通过抑制骨质疏松症大鼠的免疫功能,降低骨组织中的炎症与免疫反应水平,进而有利于骨细胞生长和BMMSC向骨细胞分化。[结 论]1.采用地塞米松诱导法成功建立大鼠骨质疏松症模型,Micro-CT扫描分析显示BMD显著降低。2.采用本实验室创建的HA-UCMSC制备方法培养获得大鼠新型HA-UCMSC。3.证实HA-UCMSC 比传统UCMSC对地塞米松诱导的大鼠骨质疏松症具有更高疗效,可更明显地改善骨组织结构,促进BMMSC的成骨分化能力,结果为临床治疗骨质疏松症提供了一种新的技术方法。4.发现HA-UCMSC通过促进WNT/β-catenin信号通路中的WNT、β-catenin和runx2的表达,抑制炎症与免疫功能,提高BMMSC的成骨活性,进而发挥对骨质疏松症的治疗作用。