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[目的]口腔癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,每年全球新增病例约30万例,新增死亡病例13万例,且近年的发病率呈现逐年上升的趋势。舌鳞癌（Tongue squamous cell carcinoma,TSCC）是最常见的口腔癌类型,临床表现隐匿,早期多无明显症状,侵袭性高,淋巴结和远处转移率高。以顺铂为主的单药或者联合化疗是舌鳞癌患者最重要的辅助治疗手段,但是化疗后耐药或者化疗不敏感是导致舌鳞癌患者顺铂化疗失败的主要原因。因此,寻找新的可以有效增加顺铂化疗敏感性的药物组合对于改善舌鳞癌患者预后至关重要。近年,CRISPR文库的兴起使得大规模的分子靶标筛选成为可能。因此,我们基于舌鳞癌患者顺铂耐药的临床问题,选择最易成药的激酶作为靶点,采用CRISPR/Cas9激酶文库在舌鳞癌细胞株中进行筛选,寻找能够增强顺铂敏感性的有效激酶及其抑制剂,探索其体内外增敏效果,目的在于为顺铂化疗耐药或者顺铂化疗不敏感的舌鳞癌患者提供新的治疗选择。[方法]1.在舌鳞癌细胞中进行CRISPR/Cas9激酶库阴性筛选首先将混合的靶向507个激酶的5171条sgRNAs文库包装成慢病毒,然后确定MOI=0.3～0.5的病毒浓度,以该病毒浓度感染Cal27和Tscca两株舌鳞癌细胞株,感染完成后通过嘌呤霉素（puromycin）筛选获得稳定感染细胞株,然后将Cal27传至4个10cm皿,分别加入0,0.125,0.25,0.5（单位:μg/ml）浓度的顺铂处理,Tscca传至三个10cm皿,分别加入0,0.5,1（单位:μg/ml）浓度的顺铂处理,48h后收集细胞,提取基因组DNA,经PCR扩增后进行sgRNAs的深度测序,生物信息学分析获取顺铂的潜在增敏靶点。2.顺铂潜在增敏靶点的验证通过对原始测序数据的分析与整合,选择排名前10的差异显著的sgRNAs对应的靶基因进行初步验证,我们选择了 CRISPR/Cas9文库中每个基因对应的变化最明显的sgRNA构建CRISPR/Cas9质粒,然后验证这些基因敲除后舌鳞癌细胞对顺铂敏感性的变化,通过CCK8检测在Tscca与Scc-9细胞系中激酶的抑制剂与顺铂单药或者联用药细胞的增殖活性变化,同时在Tscca与Scc-9中敲除该激酶后,CCK8检测顺铂处理后各组细胞增殖活性变化。通过平板克隆实验检测细胞克隆形成能力,EdU实验检测细胞DNA合成能力,Calcusyn软件计算两药的联合指数。3.探索激酶抑制增敏顺铂的机制将Tscca与Scc-9中激酶敲除组细胞与对照组细胞分为两组,一组加入顺铂处理,一组作为对照,24h后收集RNA进行转录组测序,生物信息学分析寻找差异基因。免疫荧光检测DNA损伤标志物γ-H2AX的表达水平,流式检测不同条件处理后细胞的凋亡情况,Western blot检测相关蛋白的表达情况。4.药物抑制/分子水平敲除激酶后检测顺铂的体内抗肿瘤活性裸鼠皮下接种Tscca细胞株,构建裸鼠移植瘤模型,然后给予DMSO,顺铂、激酶抑制剂,以及顺铂联合激酶抑制剂处理。此外,针对激酶敲除后,我们采用裸鼠双侧成瘤模型,左侧腋窝接种敲除组,右侧腋窝接种对照组,成瘤后随机分为两组,一组给予顺铂处理,另一组给予生理盐水处理。2周后将瘤子完整取出,比较不同处理条件下肿瘤的体积和瘤重有无明显差异。[结果]1.在舌鳞癌细胞中进行CRISPR/cas9激酶库阴性筛选对测序结果进行生物信息学分析以及整合,结果显示Tscca与Cal27一共有17个差异倍数大于2倍的公共差异基因,它们随着顺铂浓度的增加sgRNAs呈现梯度下降,我们对前10个差异显著的基因进行初步验证。结果发现,在Cal27中,敲除STK19后,细胞对顺铂的敏感性显著增加。2.抑制STK19可以增强舌鳞癌细胞对顺铂（DDP）的敏感性我们在Tscca与Scc-9两株舌鳞癌细胞株中进行DMSO、DDP、STK19抑制剂ZT-12-037-01以及ZT-12-037-01联合DDP处理,48h后通过CCK8实验检测各组细胞增殖活性,结果发现,联合处理组细胞增殖活性显著降低,克隆形成能力明显减弱,DNA合成明显抑制,且在Tscca与Scc-9中敲除STK19后用顺铂处理可以明显增加舌鳞癌细胞对顺铂的敏感性,表现在细胞的增殖活性减弱,克隆形成能力降低,DNA合成明显受到抑制。此外,抑制STK19还可以增加舌鳞癌细胞中卡铂和奈达铂的敏感性。3.抑制STK19联合顺铂明显增加顺铂诱导的舌鳞癌细胞凋亡,DNA损伤明显加重。我们对STK19敲除后的细胞进行顺铂处理24h后提取细胞RNA进行转录组测序,对测序结果进行生物信息学分析。GSEA通路富集结果显示:STK19敲除联合顺铂处理,DNA损伤、凋亡、DNA修复以及G2M检查点通路明显富集,10个DNA修复关键蛋白表达水平明显降低。流式结果显示抑制STK19后,顺铂诱导的细胞凋亡明显增加,Western blot检测结果显示线粒体凋亡相关蛋白在联合处理组明显升高,免疫荧光以及Western blot结果显示DNA损伤的关键蛋白γ-H2AX在抑制STK19后联合顺铂处理均明显升高,STK19敲除后,免疫荧光检测结果显示较对照组相比,敲除组DNA损伤出现更早,而且更严重。4.MGMT可能是抑制STK19增敏顺铂的下游靶点测序结果显示STK19敲除联合顺铂处理,MGMT的表达水平明显降低,我们采用Western blot对测序结果进行进一步验证,结果发现,ZT-12-037-01/STK19敲除联合顺铂处理后,MGMT的表达水平均明显降低,且MGMT的抑制剂Lomeguatrib可以有效逆转ZT-12-037-01联合顺铂诱导的细胞死亡。5.抑制STK19联合顺铂具有明显的体内抗肿瘤活性我们采用Tscca细胞株构建裸鼠体内移植瘤模型,检测ZT-12-037-01与顺铂单药或者联合用药对肿瘤生长的影响。结果发现,顺铂联合ZT-12-037-01组肿瘤的体积和瘤重较对照组以及单药组均明显缩小,且差异具有统计学意义。此外,较STK19未敲除组相比,STK19敲除的裸鼠移植瘤在顺铂处理下肿瘤的体积和瘤重较未敲除组明显缩小,且差异具有统计学意义。[结论]1.CRISPR文库在筛选协同致死靶点,探索耐药或增敏靶点以及机制方面是一项高效可行的工具。2.STK19是舌鳞癌中顺铂的协同致死靶点,药物抑制或者分子敲除STK19可以明显增加舌鳞癌细胞对顺铂的敏感性。3.抑制STK19联合顺铂处理舌鳞癌细胞明显增加顺铂诱导的细胞凋亡,抑制细胞DNA合成,促进DNA损伤。4.MGMT是抑制STK19增敏顺铂的重要靶点。5.抑制STK19可以明显增加顺铂的体内抗肿瘤活性。