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[目 的]骨转移是肺癌晚期最常见的并发症之一,目前肺癌骨转移的发病机制尚不明确。越来越多研究证明miRNA在恶性肿瘤转移中发挥重要调控作用。课题组前期通过高通量测序,在肺腺癌骨转移（Bone Metastasis,BM）和无骨转移（Non Bone Metastasis,NBM）患者血液样本中筛选到28个差异表达的miRNAs,其中miR-106a在BM组样本中显著性上调。采用实时定量PCR（Real-time Quantitative PCR,RT-qPCR）验证了 miR-106a表达水平与高通量测序的结果一致,提示miR-106a可能与肺腺癌骨转移密切相关。随后,通过数据库预测分析发现miR-106a与p53信号通路中的肿瘤蛋白53诱导核蛋白1（Tumor Protein 53-induced Nuclear Protein 1,TP53INP1）存在靶向结合关系。本课题拟探讨miR-106a在肺腺癌骨转移及无骨转移患者样本中的表达及临床预后的意义,通过体内外实验阐释miR-106a促进肺腺癌细胞增殖、侵袭转移的功能。进一步验证确定TP53INP1是否为miR-106a的直接作用靶点,分析两者的互作关系,并研究miR-106a通过靶向结合TP53INP1调控肺腺癌侵袭转移的分子机制。通过本项目的研究,阐明miR-106a调控肺腺癌骨转移的新机制,为临床上进一步开发靶向肺腺癌骨转移的新药物提供理论依据。[方法]第一部分:使用原位杂交（In Situ Hybridization,ISH）和RT-qPCR,检测miR-106a在80例肺腺癌骨转移和无骨转移患者的肺组织石蜡切片中的表达水平。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,建立Cox回归风险函数模型进行患者生存预后的多因素分析。第二部分:使用CCK-8实验检测转染miR-106a mimic和inhibitor对肺腺癌SPC-A1和A549细胞增殖能力的影响。用划痕实验和Transwell小室迁移实验来观察转染miR-106a的mimic和inhibitor对肺腺癌细胞的迁移、侵袭能力的影响。建立肺腺癌骨转移裸鼠模型,采用X光成像和micro-CT、HE染色等方法比较转染miR-106a agomir/antgomir对转移骨中肿瘤细胞生长和肿瘤诱导产生骨破坏的作用。进一步采用RNA转录组测序和KEGG分析,筛选两组样本中显著差异性表达的靶基因及其调控的主要代谢途径或信号通路。在SPC-A1和 A549 细胞中转染 miR-106a mimic 和 miR-106a inhibitor 后,分别采用 RT-qPCR检测p53在基因水平的表达变化和Western blot检测p53在蛋白水平的表达变化。随后,通过转染GFP-P53质粒,检测p53在细胞中的定位是否改变。应用生物信息学分析,筛选miR-106a下游直接作用的靶基因。同时,采用RT-qPCR和免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）检测miR-106a与其靶基因在肺腺癌骨转移及NBM组织中的表达情况。采用双荧光素酶报告基因实验和回补实验验证miR-106a与其靶基因的互作关系。第三部分:（1）在细胞水平,检测miR-106a/TP53INP1对A549和SPC-A1细胞迁移、侵袭能力的影响。在动物水平,分析miR-106a/TP53INP1对裸鼠肺腺癌骨转移灶形成及生长的影响。（2）采用Western blot分析miR-106a mimic转染后EMT相关蛋白表达。（3）对miR-106a mimic和TP53INP1处理的SPC-A1细胞进行流式细胞荧光分选技术（Fluorescence Activated Cell Sorting,FACS）,分析不同处理组中凋亡细胞比例。采用Western blot检测p21、Bax和Pig3等凋亡蛋白的表达情况。（4）构建GFP-LC3示踪体系,采用荧光显微镜评价miR-106a/TP53INP1对SPC-A1和A549细胞自噬活性的影响。Western blot检测miR-106a/TP53INP1对自噬标记物LC3Ⅱ和P62蛋白表达的影响。采用细胞克隆形成实验,检测自噬相关蛋白Atg5对miR-106a/TP53INP1调控SPC-A1细胞克隆形成率的影响。设置回补实验:分别加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）和敲除自噬通路关键蛋白Atg5后,检测miR-106a对SPC-A1和A549细胞迁移、侵袭能力的影响。进一步采用Atg5基因沉默细胞系,转染TP53INP1 48h后分析EMT的变化。最后在临床水平,采用IHC实验验证肺腺癌患者肺和骨组织样本中自噬通路关键蛋白表达与骨转移的相关性。[结果]第一部分:ISH实验发现,与NBM组相比,miR-106a在BM组肺组织中显著性高表达（P＜0.01）。RT-qPCR检测同样验证了该结果（P＜0.001）。相关性分析发现,BM、miR-106a表达量是患者总生存期的影响因素（P值均＜0.05）,与miR-106a低表达组相比,miR-106a高表达组的临床预后较差。患者发生骨转移和miR-106a高表达是肺腺癌患者预后不良的独立危险因素。第二部分:细胞功能实验检测结果发现,与miR-NC组相比,miR-106a mimic组显著增强了 A549和SPC-A1细胞的增殖、迁移、侵袭能力（均P＜0.05）。X光成像和micro-CT结果均证实了 miR-106a agomir转染促进了癌细胞向骨骼等组织的转移,模型裸鼠胫骨骨质破坏面积显著增加（均P＜0.05）,而miR-106a antgomir转染得到了相反的结果。注射转染miR-106a agomir肺腺癌细胞的裸鼠骨组织HE染色切片中,胫骨骨髓腔内完全被深紫色肿瘤细胞占据,骨质破坏面积比例增加。通过转录组测序发现,miR-NC和miR-106a转染细胞中差异表达的基因主要富集在p53信号通路中。生物信息学分析发现,TP53INP1、SFN、IGF1 和 ZMAT3 可能是 miR-106a 的靶基因。RT-qPCR 检测TP53INP1、SFN、IGF1和ZMAT3表达水平与RNA转录组测序结果一致。相关性分析验证了的miR-106a与TP53INP1表达水平在肺腺癌骨转移组织中呈显著负相关（P=0.04,R2=0.101）。双荧光素酶报告基因实验和细胞回补实验验证了 miR-106a与TP53INP1靶向互作关系。第三部分:（1）TP53INP1过表达显著逆转了 miR-106a对肺腺癌细胞迁移和侵袭的促进作用（P＜0.05）。TP53INP1部分拮抗了 miR-106a对模型裸鼠肺腺癌骨转移的促进作用（P＜0.05）。（2）miR-106a可降低E-cadherin水平,增加Vimentin和Snail的水平,且miR-106a增强了 smad2/3的磷酸化水平,但该作用被TP53INP1的上调所部分消除。（3）TP53INP1过表达显著增加了 SPC-A1细胞的晚期凋亡及凋亡相关蛋白p21、Bax和Pig3表达,但miR-106a可部分逆转该促进作用。（4）单独转染miR-106a mimic不影响SPC-A1和A549细胞自噬,但miR-106a mimic可显著拮抗TP53INP1过表达诱发的细胞内GFP-LC3荧光斑点增加。与miR-106a mimic组相比,miR-NC+TP53INP1组LC3Ⅱ蛋白表达增加,P62蛋白表达下降,且miR-106a mimic+TP53INP1组可部分逆转该调控作用。细胞克隆形成实验证实TP53INP1部分逆转了 miR-106a对肺腺癌细胞克隆形成率的促进,同时,沉默Atg5显著减弱了 miR-106a对集落数量的促进。划痕实验和Transwell小室迁移实验发现,加入3-MA或沉默Atg5均能显著减弱miR-106a诱导的细胞迁移、侵袭。LC3Ⅱ和P62的Western blot结果证实了Atg5 KD细胞中自噬受到抑制。与正常细胞相比,自噬抑制细胞中E-cadherin的表达水平显著上调,Snail和Vimentin表达水平显著下调。同时,TP53INP1对于EMT的抑制作用被自噬抑制所拮抗。IHC检测发现转移性骨组织中p53和TP53INP1的表达水平低于原发性肺腺癌组织,而LC3和mTOR的表达水平则高于原发性肺腺癌组织。[结论]1.与NBM组相比,miR-106a在BM组中显著性高表达,且与肺腺癌患者临床预后差相关。2.体内外实验验证了 miR-106a具有促进肺腺癌骨转移的功能。3.miR-106a可靶向结合TP53INP1,且TP53INP1与肺癌骨转移负相关。4.TP53INP1可部分逆转miR-106a对骨转移的促进作用。5.miR-106a通过TP53INP1调控了肺腺癌骨转移的关键事件EMT和自噬依赖性细胞死亡。