[背景与目的]癌症转移相关分子在癌症转移的过程发挥关键作用,可用于患者术后疾病进展风险的评估已被研究证实。转移相关蛋白1（Metastasis-associated Protein 1,MTA1）在多种癌症侵袭转移中发挥重要作用,但其在非小细胞肺癌（Non-small Cell Lung Cancer,NSCLC）侵袭转移中的作用机制未完全阐明。多病灶非小细胞肺癌（Multifocal Non-small Cell Lung Cancer,MNSCLC）在 NSCLC 的构成比逐年上升,≤3 cm MNSCLC术后管理策略的制定基于其正确的分类（多原发肺癌、肺癌肺内转移）。对于组织学类型相同的MNSCLC,目前仍缺乏临床可操作的分类标准,这导致制定术后管理策略的难度增加,严重影响患者预后。本研究旨在揭示MTA1在NSCLC侵袭转移中的作用机制,明确MTA1蛋白表达在≤3 cm MNSCLC疾病进展风险分层的临床应用。[方法]本研究分两部分:1.MTA1在NSCLC侵袭转移中的作用机制研究1.1 MTA1在NSCLC粘附、侵袭、迁移中的作用研究:根据细胞中MTA1蛋白的基础表达水平和细胞迁移能力选择实验细胞;采用CRISPR/Cas9技术构建MTA1敲除H1299细胞,采用慢病毒转染技术构建MTA1稳定过表达A549细胞;从细胞水平上评价MTA1在细胞增殖、克隆形成、侵袭、迁移、粘附中的作用;从动物水平评价MTA1对H1299细胞在裸鼠皮下移植瘤成瘤和肺转移瘤形成中的作用。1.2 MTA1通过抑制紧密连接蛋白1（Tight Junction Protein 1,TJP1）表达和调节细胞间紧密连接影响NSCLC细胞的粘附、侵袭、迁移作用研究:采用免疫沉淀联合质谱技术鉴定H1299细胞中与MTA1相互作用的蛋白;应用生物信息学技术筛选出参与肿瘤细胞粘附的MTA1互作蛋白—TJP1;采用免疫组织化学技术评价肿瘤组织中TJP1的表达水平;从免疫荧光共定位、反向免疫沉淀等方面明确MTA1与TJP1的直接相互作用;从细胞和裸鼠组织水平揭示MTA1对TJP1的调控作用;通过回复实验证明MTA1抑制TJP1表达在NSCLC细胞粘附、侵袭、迁移中的作用。2.MTA1蛋白表达在≤3 cm MNSCLC疾病进展风险分层的临床应用研究根据纳入和排除标准选择昆明医科大学第三附属医院经手术后病理确诊的≤3cm MNSCLC患者,收集患者的组织切片和临床资料;应用免疫组化技术和半定量免疫反应评分方法评价肿瘤组织中MTA1蛋白的表达水平;采用重复测量资料方差分析等方法分析MTA1蛋白表达水平与≤3 cm MNSCLC患者临床特征的相关性;应用Cox 比例风险回归模型分析MTA1蛋白表达水平在≤3cm MNSCLC疾病进展风险分层的临床应用价值。[结 果]1.MTA1在NSCLC侵袭转移中的作用机制1.1 MTA1在NSCLC粘附、侵袭、迁移中的作用:1)选用迁移能力较强且MTA1蛋白表达水平最高的H1299细胞和迁移能力较强且MTA1蛋白表达水平较低的A549细胞作为实验细胞。2)MTA1敲除的H1299细胞和MTA1稳定过表达的A549细胞构建成功。3)敲除MTA1,显著抑制H1299细胞的迁移、侵袭能力,却增强粘附能力,对增殖、克隆形成无显著影响;稳定过表达MTA1,显著增强A549细胞的迁移、侵袭能力,却抑制粘附能力,对增殖、克隆形成无显著影响。4)敲除MTA1对H1299细胞在裸鼠皮下成瘤无显著影响,却抑制H1299细胞在裸鼠形成肺转移瘤。1.2 MTA1通过抑制TJP1表达和调节细胞间紧密连接影响NSCLC细胞的粘附、侵袭、迁移作用:1)免疫沉淀产物经质谱鉴定出951个蛋白,富集分析发现细胞粘附相关蛋白在生物过程、细胞组分和分子功能中均显著富集;结合生物信息学分析和质谱鉴定蛋白的打分值,筛选出参与肿瘤细胞粘附的MTA1互作蛋白—TJP1。2)NSCLC细胞中MTA1蛋白与TJP1蛋白表达水平有负相关趋势,TJP1蛋白在NSCLC癌组织表达量低于正常肺组织。3)MTA1蛋白与TJP1蛋白共定位于NSCLC细胞的胞质、胞膜;MTA1蛋白与TJP1蛋白的直接相互作用经反向免疫沉淀实验证明。4)MTA1可抑制H1299细胞中TJP1蛋白表达水平,在裸鼠皮下移植瘤和肺转移瘤组织中有同样的效果;MTA1可调节H1299细胞的细胞间紧密连接状态;5)MTA1对H1299细胞粘附的抑制作用可以部分被TJP1回复,MTA1对H1299细胞迁移、侵袭的促进作用可以部分被TJP1回复。2.MTA1蛋白表达在≤3 cm MNSCLC疾病进展风险分层的临床应用1)符合纳入和排除标准的119例患者中多原发肺癌52例,肺癌肺内转移23例,分类不确定患者44例;其中纵隔淋巴结转移（Mediastinal Lymph Node Metastasis,MLNM）患者25例;259个病灶中腺癌244个、鳞癌7个、其他类型8个,其中156个腺癌病灶根据病理亚型的侵袭性分组:低危62、中危73、高危21;随访时间为4.27-76.53（月）,中位随访时间为25.97（月）。2)MTA1蛋白在癌旁肺组织表达呈阴性或弱阳性,在肺癌组织表达呈不同程度阳性,在癌转移淋巴结表达呈强阳性;MTA1蛋白表达于癌组织的胞核、胞质,在肺粘液腺癌主要表达于胞质;MTA1蛋白在肺癌组织免疫反应评分的中位值为5.6,MTA1蛋白高表达患者79例,低表达患者40例。3)MTA1蛋白表达水平与结节密度、MLNM、病灶分类显著相关;MTA1蛋白在MLNM患者肺癌组织表达的强阳性率显著高于无MLNM患者肺癌组织;MTA1蛋白在肺癌肺内转移癌组织的表达水平高于多原发肺癌;MTA1蛋白在肺腺癌高侵袭性病灶的表达水平高于中、低侵袭性病灶;MTA1蛋白高表达患者的无病生存期显著劣于低表达患者。4)Cox比例风险模型单因素、多因素分析结果均显示,MTA1蛋白高表达、非宣威地区、非同侧肺病变、MLNM是≤3 cm MNSCLC患者无病生存期恶化的预测因子,MTA1蛋白免疫反应评分＞5.6的患者术后疾病进展风险增加,MTA1蛋白可用于≤3 cm MNSCLC患者疾病进展风险分层评估。[结 论]1.MTA1抑制NSCLC细胞粘附,促进细胞迁移、侵袭,促进NSCLC细胞在裸鼠体内形成肺转移瘤,提示MTA1可能是反映NSCLC侵袭转移的潜在的重要分子标志物。2.MTA1能够抑制与其共定位于胞质和胞膜的TJP1蛋白表达水平,减弱细胞间紧密连接,改变细胞的粘附、迁移、侵袭能力,这可能是MTA1促进NSCLC侵袭转移的作用机制。3.MTA1蛋白表达水平与≤3 cm多病灶NSCLC患者的纵隔淋巴结转移、肺内转移和肺腺癌侵袭性显著相关,MTA1蛋白可用于≤3 cm多病灶NSCLC患者疾病进展风险分层评估,筛选出术后疾病进展的高危患者,为该类患者术后管理策略的选择提供参考。