【摘 要】
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目的:探讨脂多糖KLA（Kdo2-lipid A,类脂A,脂多糖主要活性成分）对人冠状动脉内皮细胞（HCAEC）的Toll样受体4（TLR4）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和缝隙连接蛋白43（Cx43）表达的影响和PI3K特异性抑制剂LY294002抑制TLR4/PI3K信号通路对脂多糖KLA诱导的HCAEC中TLR4、PI3K和Cx43表达的影响及其可能的信号传导机制。方法:体外对HCAEC原
【基金项目】
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Toll样受体4相关的PI3K信号通路对冠状动脉血管内皮细胞Cx43的作用,项目合同编号:2017GXNSFAA198113,广西自然科学基金；
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目的:探讨脂多糖KLA（Kdo2-lipid A,类脂A,脂多糖主要活性成分）对人冠状动脉内皮细胞（HCAEC）的Toll样受体4（TLR4）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和缝隙连接蛋白43（Cx43）表达的影响和PI3K特异性抑制剂LY294002抑制TLR4/PI3K信号通路对脂多糖KLA诱导的HCAEC中TLR4、PI3K和Cx43表达的影响及其可能的信号传导机制。方法:体外对HCAEC原代细胞进行传代培养,采用CCK8法检测不同浓度（0mg/L、0.01mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L）的脂多糖KLA诱导HCAEC 24h后的细胞存活率和不同浓度的LY294002（0μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM）干预HCAEC 24h后的细胞存活率,根据HCAEC的存活率结果并参考相应文献选取用于本研究干预HCAEC的最适宜的药物浓度。将HCAEC随机分到下列四组:（1）空白对照组、（2）KLA组（0.05mg/L）、（3）LY294002组（2.5μM）、（4）LY294002+KLA组（LY294002 2.5μM+KLA0.05mg/L）,用Western Blot法检测HCAEC空白对照组、KLA组、LY294002组和LY294002+KLA组TLR4、PI3K、Cx43蛋白表达量;用RT-PCR法检测HCAEC各组的TLR4、PI3K、Cx43 mRNA表达量。结果:（1）CCK8法检测不同浓度的脂多糖KLA对人冠状动脉内皮细胞存活率影响的结果显示:与KLA 0mg/L组（细胞存活率为100.02±1.79%）相比,KLA 0.01mg/L组（细胞存活率为99.30±2.54%）,两组间细胞存活率无统计学差异（P＞0.05）。与KLA 0mg/L组（细胞存活率为100.02±1.79%）相比,KLA 0.05mg/L组（细胞存活率为97.06±2.96%）细胞存活率降低（P＜0.05）,并且HCAEC的细胞存活率随着脂多糖KLA浓度升高呈负增长。（2）CCK8法检测不同浓度的LY294002对人冠状动脉内皮细胞存活率影响的结果显示:与LY294002 0μM组（细胞存活率为100.52±2.17%）相比,LY294002 2.5μM组（细胞活力为100.16±1.73%）,0μM组和2.5μM组之间细胞存活率无统计学差异（P＞0.05）。与LY294002 0μM组（细胞存活率为100.52±2.17%）相比,LY294002 5μM组（细胞存活率为80.85±1.74%）的细胞存活率降低（P＜0.05）,并且HCAEC的细胞存活率与LY294002浓度升高呈负增长。（3）Western Blot法检测空白对照组、KLA组、LY294002组和LY294002+KLA组的TLR4、PI3K、Cx43蛋白表达结果显示:与空白对照组TLR4（0.13±0.03）、PI3K（0.18±0.01）、Cx43（0.21±0.01）蛋白相对表达量相比,KLA组的TLR4（0.27±0.01）、PI3K（0.28±0.03）、Cx43（0.60±0.03）蛋白相对表达量均显著升高（P＜0.05）,LY294002组的PI3K（0.05±0.01）蛋白相对表达量显著下降（P＜0.05）。与KLA组TLR4（0.27±0.01）、PI3K（0.28±0.03）、Cx43（0.60±0.03）相比,LY294002+KLA组TLR4（0.07±0.01）、PI3K（0.13±0.02）、Cx43（0.41±0.05）蛋白相对表达量显著下降（P＜0.05）。（4）RT-PCR法检测空白对照组、KLA组、LY294002组和LY294002+KLA组的TLR4、PI3K、Cx43 mRNA表达结果显示:与空白对照组TLR4（1.00±0.11）、PI3K（1.00±0.06）、Cx43（1.00±0.02）mRNA相对表达量相比,KLA组TLR4（2.95±0.28）、PI3K（2.15±0.32）、Cx43（2.56±0.10）的mRNA相对表达量显著升高（P＜0.05）,LY294002组中PI3K（0.54±0.11）的mRNA相对表达量显著下降（P＜0.05）;与KLA组TLR4（2.95±0.28）、PI3K（2.15±0.32）、Cx43（2.56±0.10）相比,LY294002+KLA组TLR4（2.04±0.14）、PI3K（0.68±0.20）、Cx43（1.35±0.28）的mRNA相对表达量显著下降（P＜0.05）。结论:在体外培养的人冠状动脉内皮细胞（HCAEC）中,脂多糖KLA促进HCAEC中TLR4、PI3K、Cx43蛋白和mRNA相对表达量增加。PI3K特异性抑制剂LY294002通过抑制TLR4/PI3K信号通路减少脂多糖诱导的HCAEC中TLR4、PI3K、Cx43蛋白和mRNA相对表达量。
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