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水曲柳具有丰富的优良种质资源,而其在组培微繁过程中,器官再生效率低一直是制约水曲柳微繁的瓶颈问题。为此,我们从水曲柳杂种优势的视角出发,以东北林业大学选育的萌蘖数量多、嫁接成活率高、扦插易生根的水曲柳(♀)×小叶白蜡(♂)(Fraxinus mandshurica Rupr.×Fraxinus sogdiana Bunge.)的杂交新品种“东水1601号”(20190287)无性系为材料,通过对灭菌方法、基本培养基、植物生长调节剂等组培微繁中的关键影响因素进行研究和优化,建立了东水1601无性系的腋芽增殖途径的微繁技术;之后比较东水1601与水曲柳母本(M8)在组培微繁过程中表型、内源激素、基因表达的差异变化,探究东水1601繁殖优势形成的原因;然后克隆东水1601增殖中高表达基因FmCUC1,进行生物信息学分析和表达模式分析,进一步瞬时与稳定转化水曲柳,结合基因表达量的变化和转基因植株表型变化初步解析FmCUC1基因对芽分化的作用。主要研究结果如下:1.影响腋芽微繁的关键因素分析:在酒精和次氯酸钠双处理下,东水1601带芽茎段外植体灭菌效果最好,筛选出以WPM为基本培养基(芽启动率可达66.25%),在高浓度6-BA(1-4 mg/L)和低浓度NAA(0-0.1 mg/L)组合处理下,东水1601带芽茎段初代芽启动率高达73.09%,在低浓度TDZ(0.4-1 mg/L)处理下组培不定枝芽的分化率高达88.80%并表现出优于其他处理的分化状态,低浓度IBA(1-1.8 mg/L)有利于不定枝的生根。选出得到组培不定枝后先在含有TDZ的培养基中分化培养,再转入含有高浓度6-BA和低浓度NAA的培养基中增殖培养的培养方式更有利于组培苗的扩繁。2.东水1601腋芽微繁技术建立:以当年生未达到半木质化程度的带芽茎段为外植体,75%酒精30 s+5%次氯酸钠10 min灭菌效果最好,脱菌率达87.50%;外植体初代芽启动最适培养基为WPM+4 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA,30 d后芽启动率达73.09%;然后将组培不定枝转入WPM+0.8 mg/L TDZ中,30 d后芽分化率可达88.80%;继续转入增殖培养基WPM+6 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA,30 d后增殖系数达8.40,单株丛苗数量可高达11棵;之后将4-5 cm生长健壮的不定枝转入生根培养基WPM+1 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA中,30 d后生根率达82.50%,再移栽至草炭土:蛭石(3:1)盆中炼苗,30 d后成活率达94.70%。3.东水1601组培微繁过程中繁殖优势分析:(1)表型变化:东水1601比母本M8启动快,生长期长,增殖分化能力强;(2)内源激素变化:内源IAA与GA含量的积累是东水1601启动早,长势健壮,不易老化的重要原因;内源IAA与CTK积累是促进东水1601比母本M8分化能力强的重要因素;(3)基因表达差异变化:增殖过程中,生长素通路的FmCUC1基因高表达(为母本M8的5.99倍)可能对东水1601繁殖优势的形成产生重要影响。4.FmCUC1基因克隆及表达模式分析:克隆得到FmCUC1基因,全长807 bp,编码268个氨基酸,为稳定的疏水蛋白,近N端的第49-423位氨基酸处有一个典型的NAC-domain保守结构域,与木犀榄亲缘关系较近。亚细胞定位结果表明,FmCUC1蛋白定位于细胞核中。q RT-PCR分析可知,FmCUC1基因在顶芽的表达量最高,为对照的6.43倍;在下胚轴再生过程中,FmCUC1基因在芽点产生与丛枝形成期均高表达,分别为6 d(对照)的1.98倍和11.33倍;在种子萌发的第4 d(芽的发生阶段)和第8 d(芽的伸长阶段)FmCUC1基因表达量均达到峰值,分别为0 d的8.56倍和8.46倍。同时FmCUC1基因也会响应IAA、6-BA、BR等再生关键激素的诱导。推测FmCUC1基因在水曲柳芽再生过程中发挥重要作用。5.瞬时过表达与RNAi干扰表达FmCUC1对水曲柳再生相关基因的表达情况分析:FmCUC1基因过表达显著上调了细胞分裂素信号转导通路关键基因FmSTM和B型FmARR12的表达,下调了生长素信号转导通路关键基因FmPLT3和FmPLT5的表达,RNAi干扰表达结果相反。推测FmCUC1基因可能通过调控FmSTM基因的表达,进而促进顶端分生组织的建立,影响芽再生能力。6.FmCUC1稳定转化结果表明:遗传转化率最高为4.22%,过表达下胚轴出芽时间比空载早3 d左右,比干扰早6 d左右,过表达下胚轴平均不定芽数量(9.06个)为对照的2.77倍,为干扰的5.12倍;在基因表达方面,FmCUC1过表达后,其下游顶端分生组织形成关键基因FmSTM表达量较对照显著上调了30.62倍,RNAi干扰表达结果相反,说明FmCUC1基因可加快水曲柳芽的形成,对不定芽分化有促进作用。