不同固氮效率蚕豆根瘤菌的脂多糖及其转运蛋白研究

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近年来,在农业生产中,由于化肥的不合理施用,土壤板结、肥力退化及水体富营养化等诸多环境和生态问题日益凸显,研究开发具有增加土壤肥力、提高粮食产量、保护生态环境功能的根瘤菌-豆科植物共生固氮体系有重大意义。根瘤菌是存在于土壤中、专性好氧的革兰氏阴性细菌,能与豆科植物共生,形成根瘤菌-豆科植物共生固氮体系,将大气中的氮转变为植物可利用的化合态,为豆科植物提供营养,是生物固氮中固氮效率最高的体系。因此,研究根瘤菌-豆科植物共生固氮过程,进一步提高其固氮效率具有较大价值。根瘤菌-豆科植物共生固氮是一个复杂的生化过程,其中位于细胞外膜的脂多糖作为信号识别因子,在维持细胞膜稳定、抵御植物抗菌素伤害、保护质膜免受外界攻击、诱发宿主细胞发生免疫反应等过程中发挥重要作用,脂多糖结构的改变可引起共生结瘤过程的丧失,表明脂多糖在根瘤菌-豆科植物共固氮过程中也发挥重要作用,因此研究其作用机制可为进一步提高固氮效率提供重要依据。本实验以5株不同固氮效率根瘤菌(Bnc3-4、Blgs21-3、9Z-3、Blgs19-2和Bdz5-3)为研究对象,分析蚕豆浸提液对根瘤菌生长、根瘤菌脂多糖含量,脂多糖带型,以及根瘤菌脂多糖转运蛋白基因转录水平的影响,以期为脂多糖在根瘤菌-豆科植物共生固氮信号识别过程中的作用机制提供支持,主要研究内容和结果如下:(1)蚕豆浸提液对根瘤菌的生长有促进作用,这种促进作用随着浸提液浓度的增加而加大;当细胞生长到对数生长期后加入浸提液,菌株在较短的时间内就能表现出较快的生长速度,其中4 h前后,对Bnc3-4、Blgs21-3和9Z-3生长影响最大,而对Blgs19-2和Bdz5-3生长影响最大的时间点则为8 h左右。(2)蚕豆浸提液对不同固氮效率根瘤菌脂多糖产量和凝胶电泳带型有不同程度的影响。通过分光光度法(波长204 nm和258 nm)和硫酸-苯酚法测定脂多糖含量,结果显示浸提液处理组中脂多糖含量略高于对照组,表明蚕豆浸提液可提高根瘤菌脂多糖产量;SDS-PAGE电泳带型结果表明,不同菌株脂多糖带型,同一菌株处理组与对照组脂多糖带型均存在差异,根据电泳条带聚类分析表明根瘤菌Blgs19-2、9Z-3与根瘤菌Bdz5-3相似度较小。(3)按照蚕豆浸提液对单株根瘤菌脂多糖影响作用较大、脂多糖带型差异大且聚类系数较小的原则筛选出根瘤菌Bdz5-3与Bnc3-4,作为进一步分析脂多糖转运蛋白的研究材料。当菌株生长到指数生长期后,加入蚕豆浸提液,并在不同的时间点取样。荧光定量PCR结果表显示Lpt基因在不同时刻的转录表达水平存在差异,在同一诱导时间点,浸提液对根瘤菌的Lpt表达水平影响程度不同,但同一株菌的Lpt基因相对表达量变化趋势基本一致。加入浸提液较短的时间(15min左右)里,根瘤菌Bdz5-3的Lpt基因转录表达水平达到最高,而根瘤菌Bnc3-4中的Lpt基因则在加入浸提液8 h时达到最高。
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